第一部分慢性飲水砷暴露對(duì)小鼠皮層多巴胺能神經(jīng)傳導(dǎo)的影響目的:通過(guò)建立慢性飲水砷暴露動(dòng)物模型,觀察砷對(duì)小鼠神經(jīng)行為功能、皮層組織形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)及多巴胺能神經(jīng)傳導(dǎo)過(guò)程關(guān)鍵蛋白的影響,為揭示砷誘發(fā)皮層多巴胺能神經(jīng)傳導(dǎo)障礙提供理論依據(jù)。方法:,將64只7周雄性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為空白組、砷低劑量組(0.5 mg/L)、砷中劑量組(5 mg/L)、砷高劑量組(50 mg/L);每組16只,飲水砷暴露6個(gè)月。染毒結(jié)束后,采用Morris水迷宮評(píng)價(jià)小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力,八臂迷宮評(píng)價(jià)小鼠工作和參考記憶能力、穿梭箱評(píng)價(jià)小鼠條件反射和非條件反射能力,曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)小鼠的自主行為活動(dòng);應(yīng)用原子熒光光譜和高效液相色譜分別檢測(cè)皮層中砷及多巴胺的含量;尼氏染色和透射電子顯微鏡分別觀察皮層組織神經(jīng)元形態(tài)及突觸超微結(jié)構(gòu)變化;采用Western-blot檢測(cè)皮層多巴胺能神經(jīng)傳導(dǎo)過(guò)程中酪氨酸羥化酶(TH)、多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(DAT)、分解酶(COMT)、多巴胺受體(DRD)蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果:(1)慢性飲水砷暴露6個(gè)月后,對(duì)照組與砷暴露組小鼠體重?zé)o明顯差異(P0.05)。(2)與對(duì)照組相比:(1)Morris水迷宮結(jié)果顯示,砷暴露組小鼠游泳距離和逃避潛伏期增加(P0.05),跨平臺(tái)次數(shù)及目標(biāo)象限停留時(shí)間減少(P0.05),而兩組之間的游泳速度無(wú)明顯差異(P0.05);(2)八臂迷宮結(jié)果顯示,砷暴露組小鼠的正確潛伏期、總進(jìn)臂次數(shù)、測(cè)試時(shí)間、參考記憶錯(cuò)誤次數(shù)、工作記憶錯(cuò)誤次數(shù)均增加(P0.05);(3)穿梭箱結(jié)果顯示,砷暴露組小鼠的主動(dòng)和被動(dòng)回避時(shí)間、被動(dòng)逃避次數(shù)均隨著砷暴露劑量而增加(P0.05),而主動(dòng)回避次數(shù)明顯降低(P0.05);(4)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,砷暴露組小鼠的糞便數(shù)明顯增多(P0.05),中央?yún)^(qū)域活動(dòng)總路程和活動(dòng)時(shí)間明顯減少(P0.05),而中央?yún)^(qū)域活動(dòng)次數(shù)無(wú)明顯差異(P0.05)。(3)原子熒光光譜和高效液相色譜結(jié)果顯示,隨著砷染毒劑量的增加,皮層組織中砷含量增加,而多巴胺濃度減少(P0.05)。(4)尼氏染色結(jié)果顯示,隨著砷暴露劑量的增加尼氏小體數(shù)量減少且尼氏小體顯示空泡變性,邊緣模糊,染色變淺;透射電子顯微鏡結(jié)果顯示,砷暴露組的突觸后致密物厚度顯著大于對(duì)照組(P0.05),但突觸活性區(qū)域長(zhǎng)度、突觸間隙寬度與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異(P0.05)。(5)與對(duì)照組相比,飲水砷暴露6個(gè)月后,多巴胺能神經(jīng)傳導(dǎo)過(guò)程中的TH、DAT、COMT、DRD1、DRD2、DRD4、DRD5蛋白表達(dá)均明顯降低(P0.05),DRD3無(wú)明顯改變(P0.05)。結(jié)論:慢性飲水砷暴露影響了多巴胺的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)、分解、結(jié)合過(guò)程,導(dǎo)致小鼠皮層多巴胺含量降低,且伴隨神經(jīng)元損傷和突觸超微結(jié)構(gòu)異常,從而誘發(fā)一系列的神經(jīng)行為功能障礙。第二部分FTO在砷誘發(fā)的多巴胺能神經(jīng)傳導(dǎo)障礙中的作用目的:通過(guò)細(xì)胞模型驗(yàn)證砷暴露能否誘發(fā)多巴胺能神經(jīng)傳導(dǎo)障礙,深入探討FTO在砷誘發(fā)多巴胺能神經(jīng)傳導(dǎo)障礙中的作用,從而為靶向調(diào)控FTO基因預(yù)防或干預(yù)砷致神經(jīng)退行性疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:采用CCK-8法檢測(cè)砷染毒對(duì)PC-12細(xì)胞活性的影響;高效液相法檢測(cè)砷染毒后PC-12細(xì)胞內(nèi)多巴胺濃度,Western-blot檢測(cè)砷染毒后PC-12細(xì)胞中TH、DAT、COMT蛋白的表達(dá);采用斑點(diǎn)雜交和免疫熒光技術(shù)檢測(cè)皮層組織及PC-12細(xì)胞內(nèi)m6A的修飾水平;Western-blot檢測(cè)組織和細(xì)胞內(nèi)FTO的蛋白表達(dá)水平,免疫熒光觀察FTO與TH的共定位情況;最后借助siRNA和CRISPRa轉(zhuǎn)染技術(shù)建立FTO敲低、過(guò)表達(dá)細(xì)胞模型,并檢測(cè)m6A修飾水平及多巴胺傳導(dǎo)通路關(guān)鍵蛋白的改變。結(jié)果:(1)砷染毒24 h后,PC-12細(xì)胞活性顯著降低,且呈明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系。(2)高效液相色譜結(jié)果顯示,砷染毒后PC-12細(xì)胞中多巴胺濃度降低(P0.05),且細(xì)胞內(nèi)TH、DAT、COMT隨著染毒劑量的增加而顯著下降(P0.05),與動(dòng)物模型中趨勢(shì)一致。(3)斑點(diǎn)雜交和免疫熒光結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,砷暴露后皮層組織及PC-12細(xì)胞中m6A修飾水平明顯增加。(4)與對(duì)照組相比,砷暴露后皮層組織和PC-12細(xì)胞中FTO蛋白表達(dá)水平顯著降低(P0.05),且FTO與TH存在共定位。(5)下調(diào)FTO表達(dá),砷暴露組m6A修飾水平較對(duì)照組增加更明顯,且砷處理組的TH、DAT、COMT的蛋白表達(dá)水平明顯降低(P0.05);反之,上調(diào)FTO表達(dá),m6A的修飾水平降低,且FTO CRISPRa與砷雙重暴露組的TH、DAT、COMT蛋白表達(dá)較單獨(dú)砷暴露組有增加的趨勢(shì)(P0.05)。結(jié)論:砷暴露導(dǎo)致PC-12細(xì)胞活性降低,m6A修飾水平增加,FTO蛋白表達(dá)減少;通過(guò)下調(diào)和上調(diào)FTO表達(dá),多巴胺能傳導(dǎo)通路中的關(guān)鍵蛋白發(fā)生改變,提示m6A去甲基化酶FTO可能對(duì)砷所致的多巴胺能神經(jīng)傳導(dǎo)障礙具有調(diào)控作用。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R114
【部分圖文】：

圖 1 砷暴露對(duì)小鼠體重的影響 (mean±SD,n=64)注：* P < 0.05Figure.1 Effect of arsenite exposure on body weight of mice (mean±SD,n=Note：*P < 0.05性飲水砷暴露對(duì)小鼠神經(jīng)行為功能的影響迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果據(jù)表明，經(jīng)過(guò) 4 天的定位航行試驗(yàn)，各組小鼠的逃避潛伏期均明.05）（圖 2B）；此外，訓(xùn)練的第 3 天和第 4 天，砷暴露組小鼠逃避于對(duì)照組（P<0.05）（圖 2B）。圖 2A 所示，訓(xùn)練的第 3 天和第 高劑量處理組小鼠的游泳距離比空白組明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì).05）。各組之間游泳速度沒(méi)有明顯差異（圖 2C），表明砷暴露對(duì)小可能沒(méi)有影響�？臻g探索試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示（訓(xùn)練的第 5 天），中劑量

28圖 2 砷暴露對(duì)小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響A 游泳路程; B 逃避潛伏期; C 游泳速度; D 目標(biāo)象限停留時(shí)間E 跨平臺(tái)次數(shù); F 游泳軌跡圖注：* P < 0.05Figure.2 Effects of arsenite exposure on spatial learning and memory in miceAswim distance; B Escape latency; C speed; D Time speed in target quanrantE Number of cross platform; F Representative track maps

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文Note：*P < 0.05.2.2 八臂迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖 3A 顯示，與對(duì)照組相比，各砷暴露組小鼠的正確潛伏期與染毒劑量呈明劑量-反應(yīng)關(guān)系（P<0.05）；圖 3B 中可以看出，5 mg/L 和 50 mg/L 砷處理組的總進(jìn)臂次數(shù)多于對(duì)照組（P<0.05）；圖 3C 顯示，僅高劑量組小鼠測(cè)試時(shí)間對(duì)照組（P<0.05）；圖 3D 顯示，中劑量和高劑量小鼠的參考記憶錯(cuò)誤次數(shù)有的增加（P<0.05），且工作記憶錯(cuò)誤次數(shù)隨著染毒劑量的增加而增加（P<0.05現(xiàn)出明顯的劑量反應(yīng)關(guān)系（圖 3E）。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，慢性飲水砷暴露可導(dǎo)致小鼠的工作和參考記憶缺陷，學(xué)習(xí)能力減弱。

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