目的:尼古丁能夠通過nAChR-α7調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)育,參與神經(jīng)發(fā)生,同時(shí)由cAMP調(diào)節(jié)的鳥嘌呤核苷酸直接激活的交換因子(EPAC/cAMP-GEF)和PKA及其下游的信號(hào)分子也介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞增殖和分化、神經(jīng)元軸突靶向生長(zhǎng)。因此,我們研究尼古丁是否通過nAChR-α7介導(dǎo)EPAC及其相關(guān)信號(hào)分子的變化,從而調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)發(fā)育和神經(jīng)形成,為尼古丁暴露引起的神經(jīng)發(fā)育毒性提供合理的解釋和尋找治療的分子靶點(diǎn)。方法:1.用24小時(shí)內(nèi)C57/BL6的新生小鼠,分離海馬組織,培養(yǎng)原代小鼠海馬NSCs,細(xì)胞傳代至第3代第5天,進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色,巢蛋白Nestin鑒定神經(jīng)干細(xì)胞、SOX2標(biāo)志物鑒定神經(jīng)祖細(xì)胞、Ki-67檢測(cè)NSCs增殖率;第3代NSCs誘導(dǎo)分化,培養(yǎng)5天,DCX、Tuj1、MAP2、GFAP和S100β抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定分化能力。2.LDH毒性檢測(cè)法檢測(cè)不同濃度尼古丁(1,10,100,200,300和400 μM)對(duì)NSCs的毒性作用;不同尼古丁濃度處理細(xì)胞,CCK-8法測(cè)定尼古丁對(duì)NSCs活力影響;碘化丙啶染色,流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度尼古丁對(duì)NSCs細(xì)胞周期的影響;不同濃度尼古丁急性處理NSCs,提取蛋白,檢測(cè)p-p38MAPK、p38MAPK、pERK、ERK、pAKT、AKT、nAChR-α7、EPAC1、EPAC2、PKA、Rap1、p-CREB和CREB蛋白表達(dá)。3.第3代NSCs誘導(dǎo)分化,尼古丁持續(xù)處理7天,DCX和GFAP免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)尼古丁 10μM對(duì)NSCs分化能力的影響;提取蛋白,檢測(cè)DCX和GFAP蛋白表達(dá);分別用尼古丁、EPAC激動(dòng)劑8-CPT、EPAC抑制劑ESI-09、PKA激動(dòng)劑6-BNZ、PKA抑制劑H-89、ESI-09聯(lián)合尼古丁以及H-89聯(lián)合尼古丁條件處理細(xì)胞,DCX染色分析不同處理?xiàng)l件后DCX+神經(jīng)元樹突分支數(shù)和軸突長(zhǎng)度;提取 mRNA,qRT-PCR 檢測(cè) nAChR-α7、EPC1、EPAC2、PKA 和 Rap1 mRNA 的表達(dá)。4.第3代NSCs誘導(dǎo)分化,分別用尼古丁 10μM、nAChR-α7特異性拮抗劑MLA 10μM以及MLA聯(lián)合尼古丁處理6小時(shí),提取蛋白檢測(cè)nAChR-α7、EPC1、EPAC2、PKA和Rap1蛋白表達(dá)。結(jié)果:1.從小鼠海馬組織中成功分離NSCs,每隔3天進(jìn)行傳代,細(xì)胞成球生長(zhǎng)狀態(tài)良好;第3代細(xì)胞Nestin和SOX2染色陽性,Ki-67陽性細(xì)胞占比49%,NSCs具有分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的能力,DCX、Tuj1、MAP2、GFAP和S100β染色均呈陽性。2.尼古丁不同濃度(1,10,100,200,300和400μM)對(duì)NSCs無明顯細(xì)胞毒性;尼古丁對(duì)細(xì)胞活性的影響有劑量效應(yīng),中等濃度(100和200μM)明顯增加NSCs的細(xì)胞活性;尼古丁急性暴露促進(jìn)小鼠海馬NSCs增殖,p-p38 MAPK/p38 MAPK、pERK/ERK和pAKT/AKT明顯上調(diào),上調(diào)nAchR-α7表達(dá),上調(diào)pCREB/CREB比率。3.NSCs誘導(dǎo)分化,尼古丁增加DCX+神經(jīng)元細(xì)胞的數(shù)量,增加DCX蛋白表達(dá),降低GFAP蛋白表達(dá);尼古丁、EPAC和PKA激動(dòng)劑降低神經(jīng)元樹突分支數(shù),縮短軸突長(zhǎng)度,而EPAC和PKA抑制劑增加神經(jīng)元樹突分支數(shù)和軸突長(zhǎng)度;EPAC、PKA抑制劑聯(lián)合尼古丁處理降低尼古丁對(duì)神經(jīng)元形態(tài)可塑性的影響。4NSCs誘導(dǎo)分化,nAChR-α7特異性抑制劑(MLA)下調(diào)nAChR-α7蛋白表達(dá),及尼古丁介導(dǎo)的下游EPAC/Rap1信號(hào),但對(duì)PKA蛋白表達(dá)沒有明顯影響。結(jié)論:本研究說明了尼古丁對(duì)體外培養(yǎng)的NSCs增殖和分化均有影響。在增殖培養(yǎng)條件下,急性尼古丁暴露激活P38-MAPK、ERK和AKT信號(hào)通路,最終影響NSCs的增殖;在分化培養(yǎng)條件下,nAChR-α7特異性抑制劑下調(diào)nAChR-α7蛋白表達(dá),及尼古丁介導(dǎo)的下游EPAC/Rap1信號(hào),提示尼古丁通過nAChR-α7影響EPAC/Rap1信號(hào)的變化,促進(jìn)早期神經(jīng)元分化,影響神經(jīng)元可塑性,減少神經(jīng)元樹突分支和降低軸突長(zhǎng)度。圖[12]表[0]參[52]
【學(xué)位單位】：安徽理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R114
【部分圖文】：

圖３邋：邋ＮＳＣｓ分化能力檢測(cè)逡逑Ａ：未成熟神經(jīng)元標(biāo)記物ＤＣＸ染色；逡逑Ｂ：成熟神經(jīng)元標(biāo)記物ＭＡＰ２染色；逡逑Ｃ：ＧＦＡＰ

圖４：不同濃度尼古丁暴露對(duì)ＮＳＣｓ的細(xì)胞毒性和增殖的影響逡逑

圖５：尼古丁暴露對(duì)ＮＳＣｓ細(xì)胞周期的影響逡逑Ａ：對(duì)照組；逡逑Ｂ：尼古丁邋ｌ邋ｐＭ處理組；逡逑

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