【摘要】：目的本實驗建立巨噬細胞-成纖維細胞體外模型,將納米二氧化硅刺激的THP-1源性巨噬細胞上清作用于MRC-5,通過蛋白質組學方法檢測MRC-5蛋白表達水平變化,探討納米二氧化硅對MRC-5蛋白表達的影響,為探索人體納米二氧化硅暴露導致呼吸系統(tǒng)炎癥反應和纖維化趨勢的生物標志物提供依據(jù)。方法常規(guī)培養(yǎng)THP-1和MRC-5細胞。實驗前預先用PMA將THP-1誘導成巨噬細胞。將THP-1源性巨噬細胞隨機分為對照組和五個濃度梯度實驗組,粉塵作用濃度分別為(0、6.25、12.5、25、50、100)μg/ml,作用時間為24h。MTT法檢測細胞存活率,AnnexinV-FITC法檢測細胞凋亡率,酶偶聯(lián)比色法和TBA法分別檢測細胞上清LDH和MDA水平。同樣將MRC-5隨機分為對照組和五個濃度梯度實驗組,分別加入相應濃度處理組的巨噬細胞上清,作用時間為24h。MTT法檢測細胞增值率,樣本堿水解法檢測細胞上清Hyp的分泌水平,闡述納米二氧化硅對巨噬細胞及成纖維細胞的損傷作用,評價體外模型構建是否成功。選取巨噬細胞上清對MRC-5毒性作用最明顯的一組,使用液相-質譜儀對該組和對照組細胞蛋白進行定性、定量分析,篩選兩組間的差異蛋白。選取其中有代表性的蛋白經蛋白免疫印跡法驗證差異性,評價質譜結果的可靠性。其中,對細胞存活率、增值率等常規(guī)實驗均設立相同濃度梯度的微米二氧化硅處理組作為納米作用強度的陽性對照,差異蛋白檢測僅針對納米二氧化硅實驗組。結果1透射電鏡結果顯示,實驗所用納米顆粒粒徑在20~50nm之間;粉塵粒度儀結果顯示,無血清RMPI1640培養(yǎng)基中納米顆粒輕微團聚,平均粒徑為166.8nm。2倒置顯微鏡下觀察,納米組的巨噬細胞出現(xiàn)細胞變圓、細胞膜皺縮、胞質內產生空泡甚至破裂死亡等變化,隨著粉塵濃度的升高,胞質內顆粒物沉積量增加,細胞貼壁狀態(tài)變差。3 MTT法檢測巨噬細胞的存活率:納米組巨噬細胞存活率在粉塵濃度為6.25μg/ml時較對照組無統(tǒng)計學差異,其余各組均較對照組低(P0.05);與同濃度微米組相比,納米組在粉塵濃度為6.25、12.5、25μg/ml時細胞存活率低(P0.05),其余各組無統(tǒng)計學差異。4 Annexin V-FITC法檢測巨噬細胞凋亡水平:納米組各劑量組細胞凋亡率較對照組均高(P0.05);與同濃度微米組相比,納米組在粉塵濃度為6.25、25μg/ml時細胞凋亡率高(P0.05),其余各組無統(tǒng)計學差異。5酶偶聯(lián)比色法檢測細胞上清LDH分泌水平:納米組巨噬細胞上清LDH含量在粉塵濃度為6.25μg/ml時較對照組無統(tǒng)計學差異,其余各組細胞上清LDH含量均較對照組高(P0.05);與同濃度微米組相比,納米組在粉塵濃度為25、50、100μg/ml時巨噬細胞上清的LDH活力高(P0.05),其余各組無統(tǒng)計學差異。6 TBA法檢測細胞上清MDA分泌水平:納米組細胞上清MDA含量在粉塵濃度為6.25μg/ml時較對照組無統(tǒng)計學差異,其余組細胞上清MDA含量較對照組上升(P0.05);與同濃度微米組相比,納米各處理組MDA活力差異均無統(tǒng)計學意義。7 MTT法檢測MRC-5的增值率:納米組在粉塵濃度為6.25μg/ml時細胞增值率較對照組無統(tǒng)計學差異,其余組細胞增值率較對照組高(P0.05);與同濃度微米組相比,納米組在12.5μg/ml時細胞增值率高(P0.05),其余各組均無統(tǒng)計學差異。8樣本堿水解法檢測MRC-5上清Hyp的分泌水平::納米組在粉塵濃度為6.25、12.5μg/ml時細胞上清Hyp含量與較照組無統(tǒng)計學差異,其余各組上清Hyp含量較對照組高(P0.05);與同濃度微米組相比,粉塵濃度為100μg/ml時納米組MRC-5上清Hyp含量高(P0.05),其余各組差異無統(tǒng)計學意義。9液相-質譜儀檢測差異蛋白,western-blot法檢測差異蛋白:經檢測分析,兩組樣品共檢測蛋白質3174個,其中差異蛋白234個。差異蛋白主要富集在核糖體通路,參與調節(jié)細胞凋亡、生長與分化,監(jiān)督蛋白正確折疊,對外源性刺激產生氧化應激反應等生物過程;選擇表達上調的蛋白中與其他蛋白相互作用明顯且有代表性的P4HB和HSP90B1蛋白進行驗證差異蛋白的實驗,結果顯示,實驗組兩種目的蛋白較對照組表達均高(P0.05),驗證了質譜結果的可靠性。結論1納米二氧化硅可降低THP-1源性巨噬細胞的存活率,導致細胞損傷并發(fā)生凋亡作用,在相應濃度作用強度大于微米二氧化硅。2納米二氧化硅作用于巨噬細胞誘發(fā)其分泌的細胞因子可引起MRC-5增值和Hyp分泌量增加,在相應濃度作用強度大于微米二氧化硅。3納米二氧化硅作用于巨噬細胞誘發(fā)其分泌的細胞因子可引起MRC-5發(fā)生蛋白水平的改變,調控細胞凋亡、蛋白合成及細胞生長等生物過程。其中,SerpinB2蛋白可能是人體肺成纖維細胞暴露于納米二氧化硅顆粒引起炎癥反應和纖維化趨勢的生物標志物。圖10幅;表10個,參115篇。
【學位授予單位】：華北理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R114
【圖文】：

圖 1 納米二氧化硅顆粒透射電鏡圖Fig.1 Transmission electron micrograph of nano-silica parti

圖 2 納米二氧化硅顆粒在無血清 RMPI1640 培養(yǎng)基中粒度分布圖Fig. 2 Particle size distribution of nano-silica particles in serum-free RMPI1640 medium1.5.2 細胞形態(tài)學改變（1）THP-1 細胞狀態(tài)良好時鏡下呈大小均一，折光度好，透明無顆粒的圓形懸

A THP-1 細胞 B THP-1 源性巨噬細胞圖 3 THP-1 細胞和 THP-1 源性巨噬細胞形態(tài)（×100）Fig. 3 THP-1 cells and THP-1 derived macrophage morphology（×100）

【參考文獻】

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本文編號：2799685