【摘要】：花生過敏影響全世界約5%的兒童和1.4~2%的成人的健康,是人類健康的重大威脅之一,其中Ara h 1是花生主要過敏原之一。已有的研究顯示熱處理會改變花生的致敏性,實驗室前期研究結果表明,水煮和油炸會導致花生致敏性降低,而烘烤處理可以使花生致敏性升高,推測烘烤時發(fā)生的糖基化反應影響了花生過敏原的致敏性。故本文以花生Ara h 1蛋白為研究對象,原核表達重組Ara h 1蛋白,用干熱法模擬糖基化反應獲取終末糖基化Ara h 1蛋白,并分析了干熱處理導致Ara h 1蛋白結構的改變;進一步以BALB/c小鼠和RBL細胞為致敏性評估模型綜合評估糖基化對花生Ara h 1致敏性的影響;并在此基礎上研究了糖基化修飾影響Ara h 1致敏性的機理,揭示了糖基化修飾對過敏原在過敏反應的各個階段產(chǎn)生的影響。主要研究內容和結論如下:1重組花生Ara h 1蛋白和糖基化Ara h 1蛋白的獲取提取花生總RNA,反轉錄為cDNA,PCR擴增得到Ara h 1基因序列,將該序列克隆至pET-28a載體中,構建Ara h 1-pET-28a表達載體,進行驗證和測序,將測序成功的質粒轉入Rosetta(DE3)表達宿主菌中誘導表達,將以包涵體形式表達的重組蛋白溶解后透析復性,鎳柱純化獲取重組蛋白,經(jīng)質譜鑒定為重組花生Ara h 1蛋白(R-Ara h 1)。用干熱處理模擬糖基化反應,隨處理時間增長蛋白中游離氨基含量減少、結合糖含量增多,有果糖胺和高熒光水平小分子產(chǎn)生,推測有糖基化反應發(fā)生,質譜檢測和ELISA結果表明,在100℃干熱處60min后有終末糖基化特征結構產(chǎn)生,表明獲取了終末糖基化Ara h 1蛋白(AGE-Ara h 1)。2糖基化修飾對重組花生Ara h 1蛋白致敏性影響的研究用BALB/c小鼠和RBL細胞致敏性評估模型分別研究了糖基化修飾的重組花生Ara h 1蛋白的致敏性。用AGE-Ara h 1蛋白以皮下注射的方式免疫BALB/c小鼠,結果表明與對照R-Ara h 1相比,AGE-Ara h 1致敏的小鼠體重增長率較低,脾臟質量分數(shù)較高,空腸和肺出現(xiàn)了更嚴重的炎性浸潤和充血現(xiàn)象,腹腔灌洗液中的肥大細胞和嗜堿性粒細胞有更高程度的脫顆粒現(xiàn)象;此外小鼠血清中有更高含量Th2型細胞因子(IL-4、IL-5、IL-13)、特異性抗體(IgE、IgG)和組胺,小腸和肺中有更高水平的TSLP基因表達,表明糖基化組小鼠體內有更嚴重的Th2型過敏反應;RBL細胞實驗表明,AGE-Ara h 1致敏的小鼠血清有更高的使RBL脫顆粒能力。綜上所述,AGE-Ara h 1致敏性更高,即糖基化修飾上調了R-Ara h 1蛋白的致敏性。3糖基化反應上調花生Ara h 1蛋白致敏性的機理研究本文通過模擬胃液消化實驗、IgE結合力實驗和樹突細胞、RBL細胞模型分析了糖基化反應對重組Ara h 1蛋白在過敏反應不同階段產(chǎn)生的影響,結果表明糖基化修飾使花生Ara h 1抗消化能力上升;樹突細胞對糖基化Ara h 1有更高的攝取能力,且糖基化Ara h 1可上調樹突細胞RAGE表達和IL-10釋放;最后雖然糖基化使Ara h 1與IgE的結合能力略有下降,但增加了使RBL細胞脫顆粒的能力,進而引發(fā)更嚴重的過敏反應。
【學位授予單位】：上海大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R155
【圖文】：

肥大細胞活化，介質釋放和癥狀表現(xiàn)(圖1-1)[8]�；ㄉ粩z入后，花生過敏原可以穿過腸粘膜，進入人體的內環(huán)境�？乖蔬f細胞(antigen presenting cell，APCs)如巨噬細胞、樹突細胞或 B 淋巴細胞通過內吞作用或吞噬作用攝取這些過敏原。一旦這些過敏原被內化，它們就會被降解成寡肽并與主要的組織相容性復合物 II 類(MHC II)結合，形成MHC II 類肽復合物。隨后復合物被轉移至細胞表面，與 T 細胞受體(TCR)識別，抗原信息被呈遞給 CD4+T 細胞，該階段稱為抗原呈遞。研究表明，MHC II 類肽復合物和 TCR 之間的親和力較低

g 離心 30 min，取上清 10 μL 于 C18，3μm，250mm×75mm。1.0 譜中選 10 個強度最高的離子進行行檢索。被時 R-Ara h 1 蛋白和 AGE-A0μL；一抗為稀釋 500 倍的 CEL 抗建提取取花生總 RNA，結果見圖 2-1，提取的 RNA 完整性較好，基本

圖 2-2 花生 Ara h 1 基因的克隆Figure 2-2 Clone of Ara h 1 gene構建的 Arah1-pMD-19T 載體轉化入 DH5α 大腸桿菌中，可以看al 的 LB 平板上有白色菌落生長(圖 2-3)，挑取白斑進行通用引1、4、5 號單菌落經(jīng) PCR 擴增后在 2000bp 附近有明顯條帶，表因插入 pMD-19T 載體中。

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本文編號：2789399