【摘要】：目的:壬基酚(Nonylphenol,NP),是持久性有機(jī)污染物(persistent organic pollutants,POPs)的重要成員之一,具有神經(jīng)毒性。胎兒和兒童的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)對(duì)POPs具有高度敏感性。小膠質(zhì)細(xì)胞(Microglia,MG)是CNS中重要的固有免疫細(xì)胞,可以抵抗外源化學(xué)物的入侵。然而,這使得MG成為NP神經(jīng)毒性作用潛在的靶細(xì)胞。MG異常激活時(shí),可過(guò)量產(chǎn)生一氧化氮(nitric oxide,NO)和前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2),造成神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。因此,本研究擬探究孕哺期母體NP暴露是否能夠激活子代海馬中的MG產(chǎn)生過(guò)量的NO和PGE2及其可能機(jī)制。實(shí)驗(yàn)方法:1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn):按染毒劑量將懷孕大鼠隨機(jī)分成四組:0 mg/kg/day、10 mg/kg/day、50 mg/kg/day和100 mg/kg/day組,對(duì)孕鼠進(jìn)行相應(yīng)濃度的NP灌胃。于產(chǎn)后第7及21天取仔鼠海馬進(jìn)行試驗(yàn)。使用總一氧化氮試劑盒測(cè)定仔鼠海馬中NO含量。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)測(cè)定仔鼠海馬中PGE2含量。免疫熒光觀察仔鼠海馬MG激活情況。Western blot與免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TLR4/My D88/NF-κB信號(hào)通路與氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)變化。2.體外實(shí)驗(yàn):建立BV2小膠質(zhì)細(xì)胞系NP暴露模型,并使用TLR4特異性拮抗劑預(yù)處理BV2 MG細(xì)胞。使用總一氧化氮試劑盒測(cè)定培養(yǎng)上清中NO含量。ELISA測(cè)定培養(yǎng)上清中PGE2含量。Western blot檢測(cè)TLR4蛋白表達(dá)變化。結(jié)果:1.孕哺期NP暴露激活子代海馬中的MG。在產(chǎn)后(postnatal day,PND)第7天與PND21,NP處理組仔鼠海馬MG激活數(shù)量明顯增多,MG激活標(biāo)志物Iba1熒光強(qiáng)度增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.孕哺期NP暴露導(dǎo)致子代海馬NO分泌升高。在PND7與PND21,NP處理組中仔鼠海馬NO表達(dá)明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);在PND7與PND21,NP處理組中仔鼠海馬中i NOS蛋白表達(dá)明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),免疫熒光顯示MG中i NOS表達(dá)增加。3.孕哺期NP暴露導(dǎo)致子代海馬PGE2分泌升高。在PND7與PND21,NP處理組中仔鼠海馬中PGE2表達(dá)明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);在PND7與PND21,NP處理組中仔鼠海馬中COX-2蛋白表達(dá)明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)免疫熒光顯示MG中COX-2表達(dá)增加。4.孕哺期NP暴露可激活子代海馬中TLR4/My D88/NF-κB信號(hào)通路。在PND7與PND21,NP處理組中仔鼠海馬中TLR4蛋白表達(dá)明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);在PND7與PND21,NP處理組中仔鼠海馬中My D88和TRAF6蛋白表達(dá)明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);在PND7和PND21,孕哺期NP暴露引起仔鼠海馬中p65發(fā)生核轉(zhuǎn)移;在PND7和PND21,NP處理組中仔鼠海馬中p-p65蛋白含量明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而p65蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化。5.TLR4拮抗劑減少NP誘導(dǎo)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的NO和PGE2。50μM NP能引起B(yǎng)V2小膠質(zhì)細(xì)胞分泌的NO、PGE2表達(dá)明顯升高,結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),抑制劑預(yù)處理的BV2細(xì)胞NO、PGE2表達(dá)水平明顯低于NP處理組,結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。6.孕哺期NP暴露引起子代海馬中氧化應(yīng)激產(chǎn)生。在PND21,孕哺期NP暴露引起仔鼠海馬中4-HNE表達(dá)升高。而在PND7,4-HNE表達(dá)無(wú)明顯變化;在PND21,NP處理組中仔鼠海馬中Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而在PND7,Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化。結(jié)論:孕哺期母體NP暴露激活子代海馬中的MG,使其產(chǎn)生過(guò)量的NO和PGE2;而TLR4/My D88/NF-κB信號(hào)通路和Nrf2信號(hào)通路可能參與調(diào)節(jié)MG的激活與NO、PGE2的過(guò)量產(chǎn)生。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R114
【圖文】：

10圖 3.1.1 孕期及哺乳期 NP 暴露激活 PND7 子代海馬 MG（×2圖 3.1.1 中，標(biāo)尺為 50μm，并適用于其他免疫熒光圖；A 是 Iba1 的表達(dá)；B 是 Iba1 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì)；C 是 Iba1 的熒光強(qiáng)度測(cè)定。Iba1 可作為 MG據(jù)以 mean ±SEM 表示（n=6）；*表示與 0 mg/kg 組相比，P < 0.05；#表示比，P < 0.05；&表示與 50 mg/kg 組相比，P < 0.05

2孕期及哺乳期NP暴露激活PND21子代海馬MG（×200）

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