本文關(guān)鍵詞：分子氫在電離輻射防護(hù)作用中的機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景:2007年日本醫(yī)科大學(xué)Ohsawa[1]等研究發(fā)現(xiàn)氫氣具有很強(qiáng)抗氧化性。這一發(fā)現(xiàn),使氫氣迅速成為了學(xué)術(shù)界的研究熱點(diǎn)。目前,已經(jīng)研究并報(bào)道分子氫對(duì)多種器官和組織的多種疾病具有較好的防護(hù)和治療作用,對(duì)分子氫生物學(xué)作用的研究還在不斷深入[2,3]。本實(shí)驗(yàn)室在對(duì)分子氫生物學(xué)作用的研究中率先發(fā)現(xiàn),分子氫對(duì)電離輻射損傷有著較好的防護(hù)作用。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了分子氫對(duì)受照細(xì)胞、造血組織、心血管組織、生殖系統(tǒng)及整體動(dòng)物等均有十分顯著的防護(hù)效果[4-8]。在日本學(xué)者Ohsawa研究中,通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)分子氫是通過(guò)選擇性清除·OH和ONOO-來(lái)發(fā)揮其抗氧化作用。然而,隨著對(duì)分子氫研究的不斷深入,愈來(lái)愈多的實(shí)驗(yàn)結(jié)果已無(wú)法用單純的選擇性清除自由基來(lái)解釋。多個(gè)研究提示,分子氫或許影響了機(jī)體某些信號(hào)傳導(dǎo)通路或是基因的表達(dá)。那么,在電離輻射損傷防護(hù)當(dāng)中,分子氫又是通過(guò)何種途徑發(fā)揮其生物學(xué)作用呢?闡明分子氫發(fā)揮生物學(xué)活性的機(jī)制問(wèn)題,會(huì)為其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的更廣泛應(yīng)用提供理論依據(jù),并能促使其能好的向臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化。因此,本研究主要圍繞著分子氫在電離輻射損傷防護(hù)中的分子機(jī)制而開展。本課題主要分為三個(gè)部分。第一部分研究分子氫在無(wú)細(xì)胞體系中中和多種自由基的能力。第二部分研究以機(jī)體內(nèi)重要抗氧化酶為研究對(duì)象,檢測(cè)分子氫是否對(duì)其活性產(chǎn)生影響。第三部分探討Nrf2/ARE信號(hào)通路在分子氫輻射防護(hù)效應(yīng)中的作用。研究?jī)?nèi)容:1、分子氫對(duì)多種自由基的清除作用:通過(guò)不同的化學(xué)體系中分別產(chǎn)生不同的自由基,使用電子自旋共振技術(shù)檢測(cè)加入分子氫之后各種自由基含量的變化。2、分子氫對(duì)機(jī)體重要抗氧化酶的影響:研究分子氫在無(wú)細(xì)胞體系中對(duì)抗氧化酶活性的影響;檢測(cè)分子氫對(duì)L-02細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性的影響3、Nrf2/ARE信號(hào)通路在分子氫輻射防護(hù)效應(yīng)中的作用:建立分子氫細(xì)胞輻射防護(hù)模型,明確防護(hù)效果。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染si Nrf2,觀察干擾Nrf2后分子氫對(duì)電離輻射損傷的防護(hù)效果,對(duì)結(jié)果分析和討論。實(shí)驗(yàn)方法:1、光照核黃素生成,使用ESR檢測(cè)加入分子氫其含量的變化2、使用ESR檢測(cè)加入分子氫后DPPH自由基含量的變化3、光照血卟啉產(chǎn)生單線態(tài)氧,利用ESR檢測(cè)加入分子氫后單線態(tài)氧含量的變化4、使用比色法檢測(cè)分子氫對(duì)多種抗氧化酶活性的影響5、L-02細(xì)胞給予4Gy和8Gy 60Coγ射線照射,檢測(cè)給氫對(duì)照后細(xì)胞的凋亡率及細(xì)胞活力的影響,驗(yàn)證分子氫對(duì)L-02細(xì)胞的輻射防護(hù)作用6、使用Western blot檢測(cè)分子氫對(duì)照后細(xì)胞Nrf2蛋白表達(dá)量的影響7、使用PCR檢測(cè)分子氫對(duì)照后細(xì)胞Nrf2 m RNA表達(dá)含量的影響8、利用lipo2000轉(zhuǎn)染si Nrf2干擾L-02細(xì)胞中Nrf2的表達(dá),在RNA及蛋白水平檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果9、干擾Nrf2后檢測(cè)酶活性,探討干擾Nrf2后分子氫對(duì)照后細(xì)胞抗氧化酶活性的影響10、干擾Nrf2,檢測(cè)照后L-02細(xì)胞的凋亡情況和細(xì)胞活力,評(píng)價(jià)干擾后分子氫對(duì)細(xì)胞輻射損傷的防護(hù)效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1、在無(wú)細(xì)胞體系中產(chǎn)生多種自由基,使用ESR檢測(cè),加氫組與對(duì)照組自由基含量無(wú)明顯差異,提示分子氫在無(wú)細(xì)胞體系中不能與其直接發(fā)生反應(yīng),對(duì)其無(wú)明顯清除作用;2、在純化的SOD及CAT溶液中直接通入氫氣,檢測(cè)分子氫對(duì)抗氧化酶的直接作用。結(jié)果提示,分子氫對(duì)酶活性沒有直接影響。3、予以L-02 4Gyγ射線照射,照后24h,檢測(cè)各個(gè)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞抗氧化酶活性的影響。結(jié)果提示:分子氫可以顯著提高照射后細(xì)胞內(nèi)SOD、CAT及GSH-PX的活性。4、予以L-02 4Gy和8Gyγ射線照射,照后24h,檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況和細(xì)胞活力,結(jié)果為:細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞活力呈劑量依賴性變化,與照射組相比,加氫組能顯著降低照后細(xì)胞凋亡率及提高照后細(xì)胞活力,證明分子氫可以防護(hù)電離輻射對(duì)L-02細(xì)胞造成的損傷;5、予以L-02 4Gyγ射線照射,照后4h提取細(xì)胞RNA,檢測(cè)Nrf2 m RNA的變化,結(jié)果為:各組之間m RNA含量無(wú)明顯差異;6、予以L-02 4Gy照射,照后6h提取總蛋白,檢測(cè)Nrf2蛋白水平的變化,結(jié)果為:給氫組Nrf2蛋白量明顯增加,提示分子氫可以激活Nrf2;7、lipo2000轉(zhuǎn)染si Nrf2,結(jié)果為:Nrf2 m RNA和蛋白水平的表達(dá)均明顯下調(diào),轉(zhuǎn)染效果良好;8、干擾Nrf2后,予以L-02 4Gy照射,照后24h檢測(cè)抗氧化酶的活性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗氧化酶的活性明顯下降;9、干擾Nrf2后,予以L-02 4Gy照射,照后24h檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞活力,結(jié)果為:分子氫對(duì)照后細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞活力無(wú)明顯影響,提示干擾后分子氫對(duì)輻射損傷的保護(hù)作用下降。討論與分析:近年來(lái),國(guó)內(nèi)外的眾多研究發(fā)現(xiàn),分子氫對(duì)多種疾病具有十分顯著的防治作用。本實(shí)驗(yàn)室在對(duì)分子氫生物學(xué)效應(yīng)的研究中,率先發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了分子氫對(duì)電離輻射損傷的防治作用。目前,對(duì)于分子氫的研究,大多數(shù)停留在效應(yīng)層面,有關(guān)分子氫作用機(jī)制仍不清楚。在前期對(duì)分子氫研究的基礎(chǔ)上,我們考慮通過(guò)以下方面來(lái)探討分子氫的作用機(jī)制:1、研究分子氫在無(wú)細(xì)胞體系中中和多種自由基的能力。2、以機(jī)體內(nèi)重要抗氧化酶為研究對(duì)象,檢測(cè)分子氫是否對(duì)其活性產(chǎn)生影響。3、探討Nrf2/ARE信號(hào)通路在分子氫輻射防護(hù)效應(yīng)中的作用。經(jīng)研究我們發(fā)現(xiàn),在利用ESR對(duì)自由基含量的檢測(cè)中,并未觀察到加氫組自由基含量有明顯變化,提示在無(wú)細(xì)胞體系中分子氫對(duì)所研究的自由基并無(wú)明顯的清除作用。在對(duì)抗氧化酶的研究中,我們觀察到分子氫與酶之間的直接相互作用并不能影響其活性。而分子氫可以顯著提高照后L-02細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的活性。在此基礎(chǔ)上。我們對(duì)Nrf2信號(hào)通路進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)分子氫可以明顯上調(diào)照后細(xì)胞Nrf2的蛋白水平。進(jìn)一步地,我們對(duì)Nrf2進(jìn)行了干擾實(shí)驗(yàn),觀察到在干擾Nrf2之后,照后被分子氫上調(diào)的多種抗氧化酶不再升高,同時(shí),分子氫對(duì)L-02的輻射防護(hù)效應(yīng)也顯著下降。這些結(jié)果提示,分子氫可能通過(guò)激活Nrf2/ARE信號(hào)通路發(fā)揮其防護(hù)輻射損傷的作用。結(jié)論:1、分子氫在無(wú)細(xì)胞體系中,對(duì)所檢測(cè)自由基沒有明顯的清除作用;2、分子氫可以明顯提高照后細(xì)胞抗氧化酶活性;3、Nrf2/ARE信號(hào)通路在分子氫防護(hù)輻射損傷中發(fā)揮著重要作用。
【關(guān)鍵詞】：電離輻射(IR) 分子氫(hydrogen) 自由基(free radical) Nrf2
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R142
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-11
• 縮略詞表11-12
• 前言12-15
• 第一部分 分子氫對(duì)多種自由基的清除作用15-23
• 一、材料15-16
• 二、方法16-18
• 三、結(jié)果18-22
• 四、討論22-23
• 第二部分 分子氫對(duì)抗氧化酶的影響23-31
• 一、材料23-24
• 二、方法24-27
• 三、結(jié)果27-30
• 四、討論30-31
• 第三部分 Nrf2 在分子氫對(duì)L 02 細(xì)胞輻射防護(hù)作用中的機(jī)制研究31-47
• 一、材料31-34
• 二、方法34-38
• 三、結(jié)果38-45
• 四、討論45-47
• 全文總結(jié)47-49
• 參考文獻(xiàn)49-51
• 文獻(xiàn)綜述51-64
• 參考文獻(xiàn)58-64
• 在讀期間發(fā)表論文情況64-65
• 致謝65

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本文編號(hào)：267121