【摘要】：目的:探討六價(jià)鉻染毒引起大鼠腎臟組織的損傷后,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)移植對(duì)六價(jià)鉻致腎臟損傷的修復(fù)作用及其修復(fù)作用機(jī)制。方法:出生5-7 d的Wistar大鼠骨髓細(xì)胞培養(yǎng)于培養(yǎng)瓶中,貼壁法純化細(xì)胞、擴(kuò)增BMSCs,流式細(xì)胞儀檢測(cè)第3代BMSCs的周期以及干細(xì)胞表面標(biāo)志CD44、CD90和CD45;第3代BMSCs誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞,油紅O染色鑒定。24只Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、六價(jià)鉻致腎臟損傷的模型組和BMSCs治療組。模型組和治療組大鼠注射0.4 mg/kg·bw六價(jià)鉻離子溶液,每周連續(xù)染毒5天,染毒30天,對(duì)照組大鼠腹腔注射相同體積生理鹽水。染毒結(jié)束,治療組大鼠移植1×10~7個(gè)BMSCs,對(duì)照組和模型組給予同體積的磷酸鹽緩沖液,每天觀察、記錄大鼠的一般狀態(tài);細(xì)胞移植2周后,檢測(cè)腎臟功能血肌酐(CR)和尿素(URE)含量;稱量腎臟質(zhì)量,計(jì)算腎臟系數(shù),檢測(cè)SOD活力和MDA含量;HE染色觀察大鼠腎臟組織病理學(xué)改變;原子吸收法檢測(cè)大鼠腎臟組織中鉻含量;TUNEL法檢測(cè)腎臟組織細(xì)胞凋亡率;免疫組化和western blot檢測(cè)線粒體途徑細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax,Bcl-2,Cytochrome C(Cyt c)和Caspase 3以及線粒體自噬相關(guān)蛋白Beclin 1,P62,PINK1,Parkin,p-Parkin和LC3B的表達(dá);western blot檢測(cè)MAPK通路p38、p-p38、JNK、p-JNK、ERK和p-ERK蛋白的表達(dá);激光共聚焦顯微鏡觀察CM-Dil標(biāo)記的BMSCs在腎臟組織定位。結(jié)果:1.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定:經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè),第3代BMSCs高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志物CD44、CD90,基本不表達(dá)造血系表面標(biāo)志CD45;大多數(shù)細(xì)胞處于細(xì)胞分裂間期。誘導(dǎo)分化的脂肪細(xì)胞經(jīng)油紅O染色,細(xì)胞內(nèi)的脂滴被染成紅色。2.BMSCs移植修復(fù)六價(jià)鉻致大鼠腎臟損傷:染毒后,對(duì)照組大鼠狀態(tài)良好。模型組大鼠食欲下降,毛色偏黃無(wú)光澤。治療組大鼠相較于模型組活動(dòng)增多,食欲有所緩解。細(xì)胞移植2周后,模型組腎臟質(zhì)量顯著低于對(duì)照組(P0.05),腎臟系數(shù)顯著高于對(duì)照組和治療組(P0.05)。血液生化檢測(cè)結(jié)果顯示,治療組大鼠CR和URE含量均顯著高于對(duì)照組,低于模型組(P0.05)。氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果顯示:腎臟組織模型組SOD活性顯著低于對(duì)照組和治療組(P0.05),MDA含量顯著高于對(duì)照組和治療組(P0.05)。模型組和治療組相比,大鼠腎臟組織中六價(jià)鉻含量無(wú)顯著差異。HE染色顯示模型組腎臟組織腎小球輕微萎縮,腎小管結(jié)構(gòu)破壞,上皮細(xì)胞損害,治療組大鼠腎臟組織病理改變明顯改善。3.BMSCs移植對(duì)六價(jià)鉻致大鼠腎臟組織損傷的修復(fù)作用機(jī)制:激光共聚焦顯微鏡觀察治療組大鼠腎臟組織有CM-Dil標(biāo)記的BMSCs定位。TUNEL結(jié)果顯示,治療組大鼠腎臟細(xì)胞凋亡率顯著低于模型組,高于對(duì)照組(P0.05)。線粒體途徑細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的檢測(cè):免疫組化結(jié)果顯示:治療組大鼠腎臟組織Bax,Cyt c和Caspase 3的表達(dá)顯著高于對(duì)照組,低于模型組(P0.05);凋亡抑制蛋白Bcl-2表達(dá)顯著低于對(duì)照組,高于模型組(P0.05);western blot結(jié)果顯示:總蛋白模型組Bax表達(dá)顯著高于對(duì)照組,治療組Bcl-2和Bcl-2/Bax比值表達(dá)顯著高于模型組,低于對(duì)照組(P0.05);治療組Caspase 3和Cyt c的表達(dá)顯著高于對(duì)照組,低于模型組(P0.05)。線粒體蛋白模型組Bax表達(dá)顯著高于對(duì)照組,Bcl-2和Cyt c顯著低于治療組和對(duì)照組。去線粒體蛋白治療組Bax,Cyt c表達(dá)顯著低于模型組,高于對(duì)照組(P0.05)。線粒體自噬相關(guān)蛋白的檢測(cè):免疫組化和western blot結(jié)果,治療組Beclin 1,PINK1,Parkin,p-Parkin和LC3B的表達(dá)顯著高于對(duì)照組,低于模型組(P0.05);治療組P62的表達(dá)顯著高于模型組,低于對(duì)照組(P0.05)。MAPK信號(hào)通路的檢測(cè):結(jié)果表明治療組p-p38/p38和p-JNK/JNK比值顯著高于對(duì)照組,低于模型組(P0.05);p-ERK/ERK比值顯著低于對(duì)照組,高于模型組(P0.05)。結(jié)論:六價(jià)鉻可以在大鼠腎臟中蓄積,引起氧化應(yīng)激反應(yīng),激活p38和JNK磷酸化、抑制ERK磷酸化,從而激活腎臟組織細(xì)胞線粒體途徑的細(xì)胞凋亡和線粒體自噬。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植能夠修復(fù)六價(jià)鉻所致的腎損傷,可能通過MAPK通路抑制線粒體途徑的細(xì)胞凋亡和線粒體自噬途徑進(jìn)而修復(fù)腎臟損傷。
【圖文】：

第 3 章 結(jié) 果3.1 BMSCs 的分離、培養(yǎng)與鑒定.1.1 BMSCs 的培養(yǎng)骨髓培養(yǎng) 3 d 后，，大部分細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，形態(tài)呈橢圓形、多角形以及長(zhǎng)梭見圖 3.1A），6-7 d 時(shí)細(xì)胞 80%融合，大多數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)長(zhǎng)梭形（見圖 3.1B）。第 3 代，細(xì)胞整體呈長(zhǎng)梭形，形態(tài)均一（見圖 3.1C）。

圖 3.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè) BMSCs 的表面標(biāo)志 CD44、CD45、CD90 和周期3.1.3 BMSCs 誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞經(jīng)成脂誘導(dǎo)液誘導(dǎo)的第 3 代 BMSCs，細(xì)胞形態(tài)逐漸變圓，7d 左右脂滴出現(xiàn)逐漸變大。誘導(dǎo) 21d 后進(jìn)行油紅 O 染色，呈陽(yáng)性（見圖 3.3）。圖 3.3 BMSCs 分化成脂肪細(xì)胞（油紅 O 染色，Bar=100μm）3.2 六價(jià)鉻致腎臟損傷模型的制備
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R114

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2658966