【摘要】：目的:以HepG2細胞作為研究對象,研究鄰苯二甲酸單乙基己基酯(mono(2-ethylhexyl)phthalate,MEHP)對HepG2細胞脂肪酸及甘油三酯合成的影響,從而探討其導致肝臟脂肪變性的作用機制。方法:分別用不同濃度的MEHP(0.8、4、20、100μmol/L)以及0.05 mmol/L OA(陽性對照)染毒HepG2細胞24 h、48 h,用GPO-POD化學酶法檢測HepG2細胞內以及細胞培養(yǎng)液上清中甘油三酯(TG)的含量;用不同濃度的MEHP(0、0.01、1、10、100μmol/L)以及1 mmol/L OA(陽性對照)處理HepG2細胞48 h,采用油紅O染色法,觀察細胞內脂滴蓄積情況。不同濃度MEHP(0、0.01、1、10、100μmol/L)及1 mmol/L OA(陽性對照)染毒HepG2細胞6 h、24 h、48 h,采用q RTPCR法檢測細胞內固醇調節(jié)元件結合蛋白1(SREBP-1c)、碳水化合物反應元件結合蛋白1(Ch REBP1)、乙酰輔酶A羧化酶(ACC1)、脂肪酸合酶(FASN)、硬脂酰輔酶A去飽和酶(SCD)、長鏈脂酰輔酶A合成酶(ACSL5)、甘油-3-磷酸酰基轉移酶線粒體亞型(GPAM)、1-酰基甘油-3-磷酸酰基轉移酶(AGPAT2)、磷脂酸磷酸酶(LIPIN2)、二�；视王；D移酶(DGAT2)、P53腫瘤抑制蛋白(P53)、肉毒堿棕櫚�；D移酶1(CPT1A)、過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)的m RNA表達水平;采用Western blot方法檢測脂肪酸合成相關蛋白固醇調節(jié)元件結合蛋白1(SREBP-1)、碳水化合物反應元件結合蛋白1(Ch REBP1)、乙酰輔酶A羧化酶(ACC1)、脂肪酸合酶(FASN)、硬脂酰輔酶A去飽和酶(SCD)的表達情況。結果:1.通過油紅O染色法觀察到,MEHP染毒48 h,與陰性對照組相比,各染毒劑量組HepG2細胞內均有紅色脂滴出現,且隨著染毒劑量的升高,脂滴數量增多。2.經MEHP染毒24 h,與陰性對照組相比,HepG2細胞上清中TG含量無明顯變化,而20、100μmol/L MEHP使細胞內TG含量明顯增加。染毒48 h,100μmol/L MEHP使上清中的TG含量增加,20、100μmol/L MEHP使細胞內TG含量明顯增加。3.與陰性對照組比較,染毒6 h,僅100μmol/L MEHP使SREBP-1c m RNA表達水平增加;染毒24 h,1～100μmol/L MEHP使SREBP-1c m RNA表達水平增加;染毒48 h,10μmol/L MEHP使SREBP-1c m RNA表達水平降低。與陰性對照組比較,染毒6 h,MEHP各劑量組均使Ch REBP1 m RNA表達水平升高;染毒24 h,1～100μmol/L MEHP使Ch REBP1 m RNA表達水平升高;染毒48 h,10、100μmol/L MEHP使HepG2細胞內Ch REBP1 m RNA表達水平降低。與陰性對照組相比,染毒6 h,MEHP各劑量組均使HepG2細胞內ACC1 m RNA表達水平升高;染毒24 h,MEHP各劑量組ACC1 m RNA表達水平未見明顯差異;染毒48 h,100μmol/L MEHP使ACC1 m RNA表達水平明顯降低。與陰性對照組相比,染毒6 h,1～100μmol/L MEHP使細胞內FASN m RNA表達水平升高;染毒24 h,MEHP各劑量組均使細胞內FASN m RNA表達水平降低;染毒48 h,僅100μmol/L MEHP使細胞內FASN m RNA表達水平降低。與陰性對照組相比,染毒6 h,MEHP各劑量組均使HepG2細胞內SCD m RNA表達水平升高;染毒24 h,10、100μmol/L MEHP使細胞內SCD m RNA表達水平降低;染毒48 h,100μmol/L MEHP組SCD m RNA表達水平明顯降低。4.與陰性對照組比較,染毒6 h、24 h、48 h,10、100μmol/L MEHP均可使HepG2細胞內ACSL5 m RNA的表達水平明顯增加。與陰性對照組比較,1～100μmol/L MEHP染毒6 h,100μmol/L MEHP染毒24 h以及10、100μmol/L MEHP染毒48 h均可使HepG2細胞內GPAM m RNA的表達水平升高。各濃度MEHP染毒6h、24 h、48 h,AGPAT2 m RNA的表達水平升高。染毒6 h、24 h、48 h,LIPIN2m RNA表達水平在10、100μmol/L MEHP組均升高。與陰性對照組相比,染毒6 h,10、100μmol/L MEHP使細胞內DGAT2 m RNA的表達水平升高,染毒24 h,僅有100μmol/L MEHP可使DGAT2 m RNA表達水平升高,染毒48 h,MEHP染毒各劑量組均可使DGAT2 m RNA的表達水平升高。5.與陰性對照組比較,染毒24 h、48 h,MEHP各劑量組SREBP-1c蛋白表達水平未出現明顯差異。與陰性對照組比較,染毒24 h、48 h,10、100μmol/L MEHP組Ch REBP1蛋白表達水平明顯增加。與陰性對照組相比,染毒24 h,1～100μmol/L MEHP使細胞內ACC1蛋白表達增加;染毒48 h,1～100μmol/L MEHP使細胞內ACC1蛋白表達降低。與陰性對照組相比,染毒24 h,1～100μmol/L MEHP使FASN蛋白表達增加;染毒48 h,100μmol/L MEHP使FASN蛋白表達降低。與陰性對照組相比,染毒24 h,僅100μmol/L MEHP使SCD蛋白表達水平增加;染毒48 h,0.01～100μmol/L MEHP均使SCD蛋白表達水平降低。6.與陰性對照組比較,染毒24 h,10、100μmol/L MEHP使細胞內P53 m RNA表達水平升高;染毒48 h,僅100μmol/L MEHP使HepG2細胞內P53 m RNA表達水平升高。與陰性對照組比較,染毒24 h,10、100μmol/L MEHP使細胞內PPARαm RNA表達水平降低;染毒48 h,1～100μmol/L MEHP使細胞內PPARαm RNA表達水平降低。與陰性對照組比較,染毒24 h、48 h,10、100μmol/L MEHP均使HepG2細胞內CPT1A m RNA表達水平降低。結論:1.高劑量的MEHP接觸可導致HepG2細胞出現脂肪積累,造成脂質代謝異常。2.MEHP接觸所引起的肝細胞脂質蓄積,可能與肝細胞內甘油三酯合成增加、脂肪酸β-氧化被抑制有關。
【圖文】：

山西醫(yī)科大學碩士學位論文2 結 果2.1 通過油紅 O 染色觀察 MEHP 對 HepG2 細胞的影響由圖 1 可見，1 mmol/L OA 組可見大量脂滴出現，且圍繞著細胞膜內側邊緣呈環(huán)狀分布，說明所建立 HepG2 細胞脂肪變性的模型是成功的，可作為陽性對照組。而陰性對照組的細胞結合緊密，邊緣清晰且未見染色脂滴。與陰性對照組相比，MEHP（除 0.01 μmol/L 組外）各劑量組均可觀察到大小不等的紅色脂滴，且隨著染毒劑量組的增加，，脂滴的數量也呈增加的趨勢。

圖 6 MEHP 對 HepG2 細胞內 SREBP1、 Ch注：與陰性對照組比較，*P<0.05; n=3.2.5.2 MEHP 對 HepG2 細胞脂肪酸合成相關蛋白 如圖7A所示，染毒24h，1 100μmol/LME染毒 48 h，1 100 μmol/L MEHP 使細胞內 ACC1（P<0.05）。如圖7B所示，染毒24h，1 100μm蛋白表達增加；染毒 48 h， 100 μmol/LMEHP 和低，差異有統計學意義（P<0.05）。如圖 7C 所示使 SCD 蛋白表達水平增加；染毒 48 h，0.01 100SCD 蛋白表達水平降低（P<0.05）。
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R114

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本文編號：2637671