【摘要】：目的β腎上腺素受體激動劑(簡稱β受體激動劑)在食品中的非法添加一直是影響中國居民健康的熱點問題之一,尤其多種β受體激動劑的混合使用以及新型結(jié)構(gòu)類似物的出現(xiàn),引起居民對食品安全問題的恐慌,并且增加了市場監(jiān)管的難度。因此,β受體激動劑多殘留快速檢測技術(shù)成為社會發(fā)展的新需求。該研究主要利用分子對接技術(shù)將人工表達(dá)的β_2腎上腺素受體(β_2 adrenergic receptor,β_2AR)和熱休克蛋白27(heat shock protein 27,HSP27)與β受體激動劑分別進行分子對接,比較他們結(jié)合能力的差異性,探索HSP27用于β受體激動劑多殘留檢測的可能性。方法1.將HSP27和β_2AR分別與β受體激動劑類小分子藥物進行分子對接,比較它們與β受體激動劑類小分子藥物結(jié)合能力的差異性。2.將β_2AR基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21,表達(dá)出具有功能活性的β_2AR蛋白,對誘導(dǎo)表達(dá)條件進行優(yōu)化,并對表達(dá)的β_2AR蛋白進行純化。3.將HSP27基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21,表達(dá)出具有功能活性的HSP27蛋白,對誘導(dǎo)表達(dá)條件進行優(yōu)化,并對表達(dá)的HSP27蛋白進行純化。4.ELISA方法對β_2AR和HSP27與β受體激動劑類小分子藥物結(jié)合能力進行驗證。5.將HSP27用于檢測3種β受體激動劑類小分子藥物,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算檢出限值,探索HSP27用于β受體激動劑多殘留檢測方面的可能性。結(jié)果1.分子對接結(jié)果克倫特羅、萊克多巴胺和非諾特羅三種β受體激動劑分別與HSP27和β_2AR的對接模型圖顯示:在其形成的“配基結(jié)合小袋”中,HSP27和β_2AR與β受體激動劑類小分子藥物依靠疏水鍵和氫鍵相互作用。15組對接結(jié)果中9組HSP27的分子對接總評分值高于β_2AR。配對t檢驗分析它們結(jié)合能力的差異性具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.03)。2.β_2AR蛋白的表達(dá)與純化結(jié)果重組β_2AR基因在大腸桿菌BL21中成功表達(dá)出β_2AR蛋白,蛋白大小為47KD左右,誘導(dǎo)表達(dá)條件:在細(xì)菌生長對數(shù)期(OD=0.6~0.9)加入濃度為1.0mmol/L的IPTG,37℃,220 r/min,振蕩培養(yǎng)16 h。經(jīng)超聲破碎、離心后留取上清,在濃度為300 mmol/L咪唑洗脫液下純化出蛋白。3.HSP27蛋白的表達(dá)與純化結(jié)果HSP27基因在大腸桿菌BL21中成功表達(dá)出HSP27蛋白,蛋白大小為27 KD左右,誘導(dǎo)表達(dá)條件:在細(xì)菌生長對數(shù)期(OD=0.6~0.9)加入濃度為0.8 mmol/L的IPTG,37℃,220 r/min,振蕩培養(yǎng)16 h。經(jīng)超聲破碎、離心后留取上清,在濃度為250 mmol/L咪唑洗脫液下純化出蛋白。4.ELISA活性鑒定結(jié)果ELISA方法進行其活性鑒定,結(jié)果表明:HSP27蛋白和β_2AR蛋白與克倫特羅、萊克多巴胺和非諾特羅三種β受體激動劑的酶標(biāo)記物均能夠發(fā)生特異性反應(yīng),HSP27的OD值分別為0.685,0.662和0.525。β_2AR的OD值分別為0.448、0.320和0.362。5.HSP27在β受體激動劑檢測方面的應(yīng)用HSP27用于3種β受體激動劑類藥物檢測的結(jié)果顯示,在1μg/L~1000μg/L范圍內(nèi),HSP27與3種β受體激動劑具有較好的線性關(guān)系,萊克多巴胺和非諾特羅與克倫特羅交叉反應(yīng)率分別為52.6%和29.7%,檢出限值為1.53μg/L�？藗愄亓_、萊克多巴胺和非諾特羅的添加回收率范圍分別為52.7%~77.3%,51.7%~71.3%和52%~76.8%,重復(fù)試驗中變異系數(shù)均小于15%,表明HSP27在3種β受體激動劑類藥物檢測中具有較好的重復(fù)性。結(jié)論通過分子對接技術(shù),本研究發(fā)現(xiàn)HSP27與β受體激動劑具有較強的結(jié)合能力,并發(fā)現(xiàn)HSP27在β受體激動劑的多殘留檢測方面的作用,為β受體激動劑的多殘留檢測技術(shù)的建立提供新的思路和理論依據(jù)。
【圖文】：

3 結(jié)果3.1 分子對接結(jié)果3.1.1 分子對接模擬圖分析15 種 β 受體激動劑類小分子藥物在 SYBYL 軟件中按事先設(shè)定的程序，分別與 HSP27 和 β2AR 進行分子對接，并在 15 種 β 受體激動劑中選取 3 種具有代表性的小分子藥物，分別是克倫特羅、萊克多巴胺和非諾特羅，ELISA 對對接結(jié)果進行驗證。15 種 β 受體激動劑類小分子藥物分別與 HSP27 和 β2AR 的分子對接模型圖如圖 3.1 和 3.2 所示，β 受體激動劑類小分子藥物與 HSP27 和 β2AR大分子結(jié)構(gòu)分別在其大分子結(jié)構(gòu)形成的“配基結(jié)合小袋”中依靠疏水鍵和氫鍵相互作用，但同種 β 受體激動劑在 HSP27 和 β2AR 大分子結(jié)構(gòu)中結(jié)合形態(tài)不同。

別與 HSP27 和 β2AR 進行分子對接，并在 15 種 β 受體激動劑中選取 3 種具有代表性的小分子藥物，分別是克倫特羅、萊克多巴胺和非諾特羅，ELISA 對對接結(jié)果進行驗證。15 種 β 受體激動劑類小分子藥物分別與 HSP27 和 β2AR 的分子對接模型圖如圖 3.1 和 3.2 所示，，β 受體激動劑類小分子藥物與 HSP27 和 β2AR大分子結(jié)構(gòu)分別在其大分子結(jié)構(gòu)形成的“配基結(jié)合小袋”中依靠疏水鍵和氫鍵相互作用，但同種 β 受體激動劑在 HSP27 和 β2AR 大分子結(jié)構(gòu)中結(jié)合形態(tài)不同。A B C圖 3.1 HSP27 與 β 受體激動劑類藥物分子對接模型圖注：A：HSP27 與克倫特羅；B： HSP27 與萊克多巴胺；C：HSP27 與非諾特羅
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R155.5

【參考文獻(xiàn)】

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6 王玲;潘亞男;;分子印跡固相萃取技術(shù)在獸藥殘留分析中應(yīng)用的研究進展[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2014年03期

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8 吳堅;薛曉燕;王麗芳;郭小華;肖林林;;分子對接方法應(yīng)用與發(fā)展[J];亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥;2013年12期

9 蔣雪松;許林云;盧利群;沈飛;周宏平;;生物傳感器在食品污染物檢測中的應(yīng)用研究進展[J];食品科學(xué);2013年23期

10 袁利鵬;盧倚群;孫遠(yuǎn)明;徐振林;雷紅濤;;鹽酸克倫特羅抗體純化及直接競爭ELISA方法研究[J];食品科學(xué);2013年14期

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5 蘇華;β_2-腎上腺素受體的純化及其與藥物相互作用研究[D];西北大學(xué);2011年

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本文編號：2634421