發(fā)布時間：2020-03-12 17:27

【摘要】：砷污染已經(jīng)成為全世界廣泛關注的嚴重環(huán)境問題之一，砷中毒造成人體多器官和多系統(tǒng)損害，長期砷暴露引起皮膚癌、肺癌和肝癌等多種癌癥，但砷化物致癌機制目前尚不清楚。深入研究砷化物致癌機制對于砷中毒的防治具有十分重要的理論意義和應用價值。絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）信號通路對細胞增殖、分化、凋亡、壞死具有重要調控作用。哺乳動物細胞的MAPKs信號通路主要包括3條亞信號通路：細胞外信號轉導激酶（ERKs）信號通路，主要功能是促進細胞增殖與分化；c-Jun N-端激酶（JNKs）信號通路和p38信號通路，其主要功能是促進細胞凋亡與死亡。 微小RNA（miRNA）與多種腫瘤的發(fā)生存在著密切的關系，研究發(fā)現(xiàn)miRNA在正常組織和腫瘤組織中的表達水平存在顯著差別，從而提示miRNA在腫瘤進程中發(fā)揮重要作用。盡管miRNA的生物學作用和機制已逐漸被了解，但是其在環(huán)境致癌物所致細胞惡性轉化和致癌過程中的作用及其分子機制尚不清楚。miR-21具有調節(jié)細胞增殖、分化、凋亡與遷移的功能，其與腫瘤發(fā)生發(fā)展、侵襲轉移以及預后有密切關系。 根據(jù)本課題組以往研究發(fā)現(xiàn)低水平亞砷酸鈉（NaAsO2）慢性處理所致細胞惡性轉化和誘導miR-21表達升高等研究結果，結合文獻報道MAPKs信號通路可通過調控其下游轉錄因子如AP-1、NF-κB和Ets1等促進miR-21轉錄表達，且miR-21靶蛋白Spry1和Pdcd4可分別負反饋調控ERK和JNK信號通路。因此，我們推測miR-21與ERK/NF-κB和JNK/c-Jun的兩條反饋環(huán)路參與了低水平NaAsO2所致細胞惡性轉化過程。 為此，本研究在課題組前期構建的低水平NaAsO2慢性處理所致人胚胎肺成纖維（HELF）細胞惡性轉化模型基礎上，應用多種分子生物學方法探討miR-21與MAPKs信號通路在低水平NaAsO2所致HELF細胞惡性轉化過程中的相互作用及其分子過程，以揭示低水平砷化物所致細胞惡性轉化的部分分子機制，從而為進一步理解砷化物致癌的分子機制和尋找砷中毒的生物學標志及防治措施提供一定的科學依據(jù)。 方法 一、低水平亞砷酸鈉對HELF細胞MAPKs和PI-3Ks信號通路的影響 分別用0.0或1.0μM NaAsO2處理HELF細胞30代后；或分別用1.0μMNaAsO2處理HELF細胞0、6或24h。用Western blot檢測MAPKs相關信號分子ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、p38、p-p38，轉錄因子NF-κB p65、p-NF-κB p65、c-Jun、p-c-Jun及PI-3Ks相關信號分子Akt、p-Akt的表達水平，以觀察低水平NaAsO2對HELF細胞MAPKs和PI-3Ks信號通路的影響。 二、低水平亞砷酸鈉對HELF細胞miR-21及其靶蛋白水平的影響 分別用0.0或1.0μM NaAsO2慢性處理HELF細胞30代后；或分別用0.0或1.0μM NaAsO2處理HELF細胞0、6或24h。用實時定量PCR（qRT-PCR）檢測miR-21水平；分別用Western blot和RT-PCR檢測miR-21靶基因Pdcd4和Spry1的蛋白水平和mRNA水平，以觀察低水平NaAsO2對HELF細胞miR-21及其靶蛋白水平的影響。 三、MAPKs和PI-3Ks信號通路在低水平亞砷酸鈉所致HELF細胞miR-21水平升高及其靶蛋白水平降低中的作用 分別用10.0μM Akt抑制劑LY294002、ERK抑制劑U0126或JNK抑制劑SP600125處理HELF-30T細胞后，或分別用20nM Con siRNA、NF-κB p65siRNA或c-Jun siRNA處理HELF-30T細胞后，用Western blot檢測Akt、ERK、JNK、NF-κBp65和c-Jun水平及其磷酸化程度及Pdcd4、Spry1、cleaved caspase-3和caspase-3水平；用qRT-PCR檢測miR-21水平；用RT-PCR檢測Pdcd4和Spry1mRNA水平，以觀察MAPKs和PI-3Ks信號通路在低水平NaAsO2所致惡性轉化HELF細胞miR-21水平升高和其靶蛋白Pdcd4和Spry1水平降低及細胞凋亡中的作用。 四、miR-21在低水平亞砷酸鈉所致HELF細胞Pdcd4和Spry1蛋白水平降低中的作用 分別用150nM anti-miR-nc或anti-miR-21轉染HELF-30T細胞24h后，或分別用100nM miR-nc-mimic或miR-21-mimic轉染正常HELF細胞24h后，用qRT-PCR檢測miR-21水平；分別用Western blot和RT-PCR檢測Pdcd4和Spry1的蛋白和mRNA水平，以從反向和正向觀察miR-21在低水平NaAsO2所致HELF細胞靶蛋白Pdcd4和Spry1水平降低中的作用。 五、miR-21通過Pdcd4和Spry1分別反饋調控JNK和ERK信號通路 用150nM anti-miR-nc或anti-miR-21轉染HELF-30T細胞24h后，或用pIRES-Pdcd4或pIRES-Spry1質粒分別轉染HELF-30T細胞24h后，用Western blot檢測JNK、c-Jun、ERK和NF-κB蛋白水平及其磷酸化程度、Pdcd4和Spry1蛋白水平，以從反向和正向觀察miR-21在低水平NaAsO2所致惡性轉化HELF細胞中通過Pdcd4和Spry1分別反饋調控JNK和ERK信號通路。 六、miR-21對低水平亞砷酸鈉所致惡性轉化HELF細胞惡性程度、遷移能力及細胞凋亡的影響 分別用150nM anti-miR-nc或anti-miR-21轉染HELF-30T細胞24h后，用軟瓊脂集落實驗檢測細胞惡性程度；用劃痕實驗檢測細胞遷移能力；用Westernblot檢測cleaved caspase-3和caspase-3水平，以觀察下調miR-21對低水平NaAsO2所致惡性轉化HELF細胞的惡性程度、遷移能力及細胞凋亡的影響。 結果 一、低水平亞砷酸鈉對HELF細胞MAPKs和PI-3Ks信號通路的影響 結果發(fā)現(xiàn)1.0μM NaAsO2慢性處理和急性處理均引起HELF細胞p-ERK和p-JNK、p-NF-κB p65、p-c-Jun和p-Akt水平明顯升高，而p-p38水平未見明顯改變。說明低水平NaAsO2可激活MAPKs信號通路中的ERK和JNK，而對p38影響不大，并可激活PI-3Ks信號通路中的Akt及轉錄因子NF-κB和c-Jun。 二、低水平亞砷酸鈉對HELF細胞miR-21及其靶蛋白水平的影響 結果發(fā)現(xiàn)1.0μM NaAsO2慢性和急性處理均引起HELF細胞miR-21水平明顯升高，而其靶蛋白Pdcd4和Spry1蛋白水平明顯降低，但Pdcd4和Spry1mRNA水平未見明顯改變。說明低水平NaAsO2引起HELF細胞miR-21水平升高和Pdcd4及Spry1蛋白水平降低。 三、MAPKs和PI-3Ks信號通路在低水平亞砷酸鈉所致HELF細胞miR-21水平升高及其靶蛋白水平降低中的作用 結果發(fā)現(xiàn)ERK抑制劑U0126和JNK抑制劑SP600125均能引起HELF-30T細胞miR-21水平明顯降低，而Spry1和Pdcd4蛋白水平明顯升高，并使cleavedcaspase-3水平升高而caspase-3水平降低，而Spry1和Pdcd4的mRNA水平未發(fā)生明顯改變；而Akt抑制劑LY294002處理后對上述指標均無明顯改變。關閉NF-κB p65和c-Jun均明顯引起HELF-30T細胞miR-21水平明顯降低，，而Spry1和Pdcd4蛋白水平明顯增加，cleaved caspase-3水平升高和caspase-3水平降低，但Spry1和Pdcd4mRNA水平未見明顯變化。說明ERK/NF-κB和JNK/c-Jun信號通路而非PI-3Ks信號通路參與了低水平NaAsO2慢性處理所致惡性轉化HELF細胞miR-21水平升高，Spry1和Pdcd4蛋白水平降低及細胞凋亡。 四、miR-21在低水平亞砷酸鈉所致HELF細胞Pdcd4和Spry1蛋白水平降低中的作用 結果發(fā)現(xiàn)轉染anti-miR-21的HELF-30T細胞miR-21水平明顯降低，且Pdcd4和Spry1蛋白水平均顯著高于未轉染HELF-30T細胞；轉染miR-21-mimic的正常HELF細胞miR-21水平也明顯升高，而其Pdcd4和Spry1蛋白水平均顯著降低，但是Pdcd4和Spry1mRNA水平均未發(fā)生明顯改變。說明在低水平NaAsO2所致HELF細胞惡性轉化過程中miR-21通過調控Pdcd4和Spry1蛋白水平發(fā)揮作用。 五、miR-21通過Pdcd4和Spry1分別反饋調控JNK和ERK信號通路 結果發(fā)現(xiàn)通過anti-miR-21下調miR-21水平后，HELF-30T細胞Pdcd4和Spry1蛋白水平升高，而p-JNK和p-ERK水平降低；轉染pIRES-Pdcd4重組質粒上調Pdcd4水平后，HELF-30T細胞p-JNK和p-c-Jun水平明顯降低；轉染pIRES-Spry1重組質粒上調Spry1水平后，HELF-30T細胞p-ERK和p-NF-κB p65水平明顯降低。說明miR-21在低水平NaAsO2所致惡性轉化HELF細胞中通過靶蛋白Pdcd4和Spry1分別反饋調控JNK/c-Jun和ERK/NF-κB信號通路。 六、miR-21對低水平亞砷酸鈉所致惡性轉化HELF細胞惡性程度、遷移能力及細胞凋亡的影響 結果發(fā)現(xiàn)通過轉染anti-miR-21下調miR-21的HELF-30T細胞在軟瓊脂上形成的集落數(shù)明顯低于對照HELF-30T細胞，且集落大小也明顯變小，其劃痕愈合率也明顯低于對照HELF-30T細胞，而cleaved caspase-3水平升高和caspase-3水平降低。說明下調miR-21可明顯降低低水平NaAsO2所致惡性轉化HELF細胞的惡性程度、遷移能力和促進細胞凋亡。 結論 1、低水平NaAsO2可激活HELF細胞MAPKs信號通路中的ERK和JNK，而對p38影響不大，并可激活PI-3Ks信號通路中的Akt及轉錄因子NF-κB和c-Jun。 2、低水平NaAsO2所致惡性轉化HELF細胞中miR-21水平升高而Pdcd4和Spry1蛋白水平降低。 3、ERK/NF-κB和JNK/c-Jun信號通路而非PI-3Ks信號通路參與了低水平NaAsO2慢性處理所致HELF細胞miR-21水平升高和Spry1和Pdcd4蛋白水平降低及細胞凋亡。 4、miR-21在低水平NaAsO2所致惡性轉化HELF細胞中可通過靶蛋白Pdcd4和Spry1分別反饋調控JNK和ERK信號通路。 5、miR-21促進低水平NaAsO2所致惡性轉化HELF細胞的惡性程度和遷移能力及抑制細胞凋亡。 總之，本研究結果提示低水平NaAsO2激活ERK/NF-κB和JNK/c-Jun信號通路，引起miR-21水平升高而抑制靶蛋白Spry1和Pdcd4表達水平，從而引起HELF細胞異常增殖和細胞凋亡減少，最終導致細胞惡性轉化，而且miR-21又可通過Spry1和Pdcd4分別反饋調控ERK/NF-κB和JNK/c-Jun信號通路。本研究結果說明miR-21與MAPKs信號通路反饋調控在NaAsO2所致HELF細胞惡性轉化中發(fā)揮重要作用。
【圖文】：

慢性處理可激活MAPKs信號通路中的ERK和JNK，而對p38影響不大，并可激活PI-3Ks信號通路中的Akt及轉錄因子NF-κB和c-Jun。圖1. 低水平NaAsO2慢性處理對HELF細胞MAPKs和PI-3Ks信號通路的影響A和B：Western blot圖；C：相對蛋白水平。與同代對照相比：**P<0.01

信號通路中的ERK和JNK，而對p38影響不大，并可激活PI-3Ks信號通路中的Akt及轉錄因子NF-κB和c-Jun。圖2. 低水平NaAsO2急性處理對HELF細胞MAPKs和PI-3Ks信號通路的影響A和B：Western blot圖；C：相對蛋白水平。與對照相比：**P<0.01
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R114

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前6條

1 方國強;吳炳禮;李恩民;許麗艷;;miR-21與腫瘤[J];癌變.畸變.突變;2010年01期

2 蔣義國;楊巧媛;;環(huán)境化學致癌研究若干熱點與問題[J];環(huán)境與健康雜志;2010年05期

3 楊陽;甘福生;汪泱;;miRNA與阿爾茲海默氏病[J];實驗與檢驗醫(yī)學;2010年02期

4 李繼霞,周克元;miRNA的研究進展[J];生物化學與生物物理進展;2003年05期

5 張韻;歐兵;吳君;;砷致肝細胞的炎癥反應及凋亡[J];世界華人消化雜志;2007年21期

6 劉利英;徐紀茹;宋土生;黃辰;;miRNA及其靶位點多態(tài)性的研究進展[J];遺傳;2010年11期

本文編號：2586586