【摘要】：在全球化背景下,由食源性致病菌引起的疾病呈現高發(fā)態(tài)勢,嚴重威脅人們的健康,阻礙社會經濟的發(fā)展,成為全球共同關注的問題。食品在生產加工、運輸貯存以及銷售等各個環(huán)節(jié)都可能受到細菌的污染,而且食品工業(yè)門類多、產量大、流通廣,所以需要快速有效、成本友好、設計簡單的細菌檢測手段來確保食品過程的安全。隨著核酸研究的不斷發(fā)展,具有特異性識別能力的功能核酸,尤其是核酸適配體和分子信標,因其方便合成、易于修飾、穩(wěn)定性好、特異性高等特點在食品安全領域展現出巨大的應用潛力。本論文分別基于核酸適配體對菌細胞表面特殊位點的識別和分子信標對細菌特異性核酸的識別構建了兩種不同的食源性致病菌快速檢測方法。(1)以36XC學生顯微鏡為基礎,自制套筒式連接器安裝暗場聚光鏡,自制高度調節(jié)指針指示焦點高度,將36XC顯微鏡改造成便攜式暗場顯微鏡作為檢測設備。采用檸檬酸三鈉還原法合成粒徑60 nm的金納米顆粒,并用紫外可見光譜儀和透射電子顯微鏡表征。將修飾核酸適配體的金納米顆粒作為識別目標和報告信號的功能化散射探針。使用透射電子顯微鏡表征散射探針對目標的結合能力,發(fā)現細菌表面的完整性是細菌能和適配體結合的必要條件,證明功能化金納米顆粒散射探針檢測的是金黃色葡萄球菌活菌。暗場鏡檢采用10倍物鏡,分為直接暗場鏡檢和間接暗場鏡檢。直接暗場鏡檢通過觀察聚集在目標表面的散射探針發(fā)出的葡萄串狀分布散射光點來實現對金黃色葡萄球菌的可視化識別;間接暗場鏡檢的第一步是過濾洗去未結合的功能化金納米探針,再將細菌表面結合的散射探針洗脫分離并對分離出的金納米顆粒進行暗場鏡檢,通過多步特異性分離的方法檢驗目標物的存在。對不同濃度的金黃色葡萄球菌分別采取間接暗場鏡檢法進行定性的檢測分析,結果顯示對金黃色葡萄球菌的陽性判定檢測限為4.6×10~6CFU/m L。通過將分離步驟中使用的水系針式過濾器替換為核酸純化柱,優(yōu)化了過濾洗滌和洗脫的操作,將方法的檢測限降低為2.9×10~3 CFU/m L,實現三個數量級的靈敏度改進,而且通過簡單的前處理即可實現實際牛奶樣品中金黃色葡萄球菌的檢測。(2)基于循環(huán)鏈置換聚合酶反應(CSDPR)原理,以金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、腸出血性大腸埃希氏菌(EHEC)和志賀氏菌為目標細菌,選取目標細菌特異性的基因區(qū)間設計分子信標熒光探針和循環(huán)引物,建立CSDPR反應體系。通過優(yōu)化實驗確定分子信標熒光探針莖結構的最佳長度為8 nt;探針和引物的最佳濃度均為200 nmol/L。針對以上四種目標菌,以非致病性大腸埃希氏菌、表皮葡萄球菌、白色葡萄球菌等額外六種細菌為對照菌,探究CSDPR檢測方法下探針的特異性,結果顯示金黃色葡萄球菌探針能夠精確鑒定到相應的菌種(species),EHEC探針能夠特異性鑒定EHEC,沙門氏菌和志賀氏菌探針則能鑒定到相應的菌屬(genus)。以各稀釋梯度的四種目標菌基因組DNA為模板,進行CSDPR擴增反應,建立定量CSDPR模型,實現對目標細菌的定量檢測。其中,對金黃色葡萄球菌的定量分析線性范圍為2×10~5~2.5×10~6 CFU/m L,檢測限為9.5×10~4 CFU/m L;對沙門氏菌、EHEC、志賀氏菌的定量分析線性范圍為1.0×10~4~1.0×10~6 CFU/m L,檢測限分別為4.8×10~4 CFU/m L、3.4×10~4 CFU/m L、3.0×10~4CFU/m L。以金黃色葡萄球菌為目標菌,人工添加低濃度(9.2×10~1 CFU/m L、9.2×10~2CFU/m L、9.2×10~3 CFU/m L)的金黃色葡萄球菌至牛排、牛奶樣品中進行增菌培養(yǎng),分別于4 h、6 h、8 h、10 h、12 h五個時間點對菌液進行平板計數和定量CSDPR檢測,并比較平板計數和定量分析的結果。結果顯示通過最短6 h的增菌培養(yǎng)即可檢出國標限量濃度下的金黃色葡萄球菌;在牛排樣品和牛奶樣品中金黃色葡萄球菌的平板計數結果和CSDPR定量檢測結果的平均相對誤差分別為14.5%和11.4%。
【圖文】：

第二章 適配體功能化金納米散射探針檢測金黃色葡萄球菌光鏡相連后，通過接件外側自鎖性較好的三角形螺紋同螺帽式接件連接。因為螺帽式接件上端具有和載物臺中央螺旋接口吻合的三角螺紋，所以套筒式連接器可以整體連接在載物臺下。通過轉動螺栓式接件，可以調整暗場聚光鏡的高度，使其與載物臺上表面吻合，也可以輔助調節(jié)焦點高度。改裝后的暗場顯微鏡，既可以直接用肉眼通過目鏡觀察，也可以使用 CCD 接口連接的相機進行觀察和拍攝。為了便于在樣品觀察時進行快速聚焦調節(jié)，，在圖 2-1（c）和（d）中圈出的位置標上記號，用一片通過強力膠粘在載物臺邊緣的載玻片作為高度指針。在使用 10 倍物鏡觀察時，調節(jié)粗準焦螺旋至高度指針上表面與圓圈處標記持平，此時目鏡中觀察到的即為載玻片的上表面（蓋玻片的下表面）處的待觀測物，繼續(xù)調節(jié)細準焦螺旋即可看清樣品。這個微小的設計可以有效縮短焦距調節(jié)時間，也可以避免錯誤對焦（比如焦點對準的是載玻片下表面）引起的錯誤觀察。

江南大學碩士學位論文納米顆粒的表征外可見吸收光譜對前面合成的金納米顆粒進行表征后得到如圖 2-2（a）所光譜中有一個單一吸收峰出現在 532 nm 附近，峰寬較窄，證明金納米顆徑大小較為接近，可以作為良好載體進行核酸適配體修飾。根據 Haiss 等米粒徑與紫外可見吸收峰的關系可以得出當峰值在 532 nm 時，其粒徑大。圖 2-2（b）是金納米顆粒的透射電鏡圖，由圖可知，金納米顆粒的粒徑分散性較好，粒徑分布較為均一，符合預期，也與紫外可見吸收光譜圖的
【學位授予單位】：江南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R155.3

【參考文獻】

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本文編號：2575687