【摘要】：目的:優(yōu)化蛋白質(zhì)芯片技術(shù)同時(shí)定量檢測(cè)牛乳中β-Lg和Lf的檢測(cè)條件,建立相應(yīng)的檢測(cè)方法,并對(duì)此檢測(cè)方法的應(yīng)用進(jìn)行評(píng)價(jià)。方法:基于雙抗體夾心法檢測(cè)抗原的原理,利用蛋白芯片對(duì)所選的β-Lg抗體、抗原和Lf抗體、抗原進(jìn)行鼠單克隆抗體的篩選、探針?lè)N類(lèi)的選擇、固定探針濃度與檢測(cè)抗體濃度組合、點(diǎn)樣一致性確定、封閉劑種類(lèi)優(yōu)化、生物檢測(cè)限與檢測(cè)下限、S型曲線的建立與線性范圍的判斷、標(biāo)準(zhǔn)曲線與回歸方程的建立等實(shí)驗(yàn)研究,優(yōu)化并確定了蛋白芯片技術(shù)同時(shí)檢測(cè)牛乳β-Lg與Lf的檢測(cè)條件。在檢測(cè)條件確定的基礎(chǔ)上對(duì)同時(shí)定量檢測(cè)兩種目標(biāo)蛋白的蛋白芯片技術(shù)的準(zhǔn)確度、精密度、方法學(xué)對(duì)照及檢測(cè)時(shí)效進(jìn)行研究和評(píng)價(jià)。結(jié)果:鼠單克隆抗體篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明所選β-Lg抗原、Lf抗原在芯片上能與各自相應(yīng)的抗體結(jié)合,而β-Lg鼠單克隆抗體66#和Lf鼠單克隆抗體75#特異性最好。點(diǎn)樣探針優(yōu)化實(shí)驗(yàn)證明β-Lg、Lf兩種蛋白的鼠單抗為固定探針時(shí)結(jié)果優(yōu)于兔多抗為探針時(shí)的結(jié)果。β-Lg固定探針與檢測(cè)抗體的濃度組合為:β-Lg鼠單克隆抗體66#的固定濃度為0.5 mg/mL,β-Lg兔多抗的檢測(cè)效價(jià)為1:2000;Lf固定探針與檢測(cè)抗體的濃度組合為:Lf鼠單克隆抗體75#的固定濃度為0.5 mg/mL,Lf兔多抗的檢測(cè)效價(jià)為1:2000。點(diǎn)樣一致性實(shí)驗(yàn)顯示:為同時(shí)保證β-Lg鼠單克隆抗體66#和Lf鼠單克隆抗體75#兩種抗體理想的點(diǎn)樣效果,點(diǎn)制芯片時(shí)每次取樣后必須預(yù)點(diǎn)46點(diǎn),同時(shí)預(yù)點(diǎn)后的點(diǎn)樣數(shù)應(yīng)控制在44個(gè)點(diǎn)以?xún)?nèi)。選擇1%WB無(wú)蛋白封閉液作為封閉劑。β-Lg生物檢測(cè)限為33.52 ng/mL、檢測(cè)下限為5.41 ng/mL,Lf生物檢測(cè)限為3.60 ng/mL、檢測(cè)下限為0.96 ng/mL。β-Lg抗原濃度在134.06-4290.00 ng/mL范圍內(nèi)與檢測(cè)信號(hào)值成線性關(guān)系,Lf抗原濃度在14.40-460.75 ng/mL范圍內(nèi)與檢測(cè)信號(hào)值成線性關(guān)系,在線性范圍內(nèi)選擇五點(diǎn)建立同時(shí)檢測(cè)兩種蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線。β-Lg稀釋回收率在50.4%-112.7%之間、加標(biāo)回收率在86%-107%之間,Lf稀釋回收率在106.5%-144.8%之間、加標(biāo)回收率在83.7%-128.5%之間。蛋白芯片法同時(shí)檢測(cè)β-Lg和Lf的結(jié)果與ELISA法對(duì)兩種目標(biāo)蛋白分別進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,兩種方法檢測(cè)β-Lg和Lf的相關(guān)系數(shù)分別為0.743和0.773,并且相關(guān)系數(shù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。β-Lg批內(nèi)變異系數(shù)在7.6%-11.6%之間、批間變異系數(shù)在14.9%-33.5%之間,Lf批內(nèi)變異系數(shù)在4.9%-14.2%之間、批間變異系數(shù)在24.8%-38.3%之間。完成抗原抗體反應(yīng)后10天之內(nèi),蛋白芯片檢測(cè)樣品濃度之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論:優(yōu)化了用于牛乳β-Lg和Lf檢測(cè)的蛋白芯片檢測(cè)條件,從而建立了同時(shí)定量檢測(cè)牛乳β-Lg和Lf的蛋白芯片平臺(tái)。
【圖文】：

中國(guó)疾病預(yù)防控制中心營(yíng)養(yǎng)與健康所碩士學(xué)位論文表１－３三株Ｌｆ鼠單抗與Ｌｆ結(jié)合的信號(hào)值比較逡逑Ｔａｂｌｅ邋１－３邋Ｔｈｅ邋ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｓｉｇｎａｌ邋ｖａｌｕｅ邋ｏｆ邋ｔｈｒｅｅ邋Ｌｆ邋ｍｏｕｓｅ邋ｍｏｎｏｃｌｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ邋ｒｅａｃｔｉｎｇ邋ｗｉｔｈ邋Ｌｆ邋（ｎ＝３，邋ｘ邋±邋Ｓ＇）逡逑組別邐Ｌｆ鼠單抗１＃邐Ｌｆ鼠單抗３５＃邐Ｌｆ鼠單抗７５＃Ｌｆ邋高抗原邐５７７６９±３０邐５２６０６±９０１３邐５７６７６邋土邋２９逡逑Ｌｆ邋低抗原邐６４０９７±３５邐３３５９５±６６５２邐３６３７５±４４７陰性對(duì)照組邐３５３７±４８３邋ｕ’２）邐８８０±５１５邐６３４±１６８注：（１）與Ｌｆ鼠單抗３５＃比較，尸＜０．邋０５；邋（２）與Ｌｆ鼠單抗７５＃比較，尸＜０．邋０

從兩種鼠單抗的點(diǎn)樣一致性掃描圖和點(diǎn)樣一致性分析圖中可以看出：點(diǎn)樣數(shù)逡逑在第４４？第９２點(diǎn)之間，（Ｂ邋－Ｌｇ鼠單抗６６＃的點(diǎn)樣效果趨于一致。在第４３點(diǎn)和第逡逑９３點(diǎn)，（３邋－Ｌｇ鼠單抗６６＃的信號(hào)強(qiáng)度均出現(xiàn)陡降（圖１－３、圖１－５）。但對(duì)于Ｌｆ逡逑鼠單抗７５＃來(lái)說(shuō)，點(diǎn)樣數(shù)在第４７？第９０點(diǎn)之間，Ｌｆ鼠單抗７５＃的點(diǎn)樣效果趨于逡逑一致。在第４６點(diǎn)和第９１點(diǎn)，Ｌｆ鼠單抗７５＃的信號(hào)強(qiáng)度均出現(xiàn)陡降（圖１－４、逡逑圖邋１－５）。逡逑因此，為同時(shí)保證（３邋－Ｌｇ鼠單抗６６＃和Ｌｆ鼠單抗７５＃兩種抗體理想的點(diǎn)樣效逡逑果，，點(diǎn)制芯片時(shí)必須預(yù)點(diǎn)４６點(diǎn)，同時(shí)應(yīng)保證單次沾樣后的點(diǎn)樣數(shù)應(yīng)控制在４４逡逑個(gè)點(diǎn)以?xún)?nèi)。逡逑圖１－３邋（Ｊ－Ｌｇ鼠單抗６６＃邋（０．５邋ｍｇ／ｍＬ）點(diǎn)樣一致性掃描圖逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－３邋Ｔｈｅ邋ｉｍａｇｅ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ邋ｏｆ邋ｄｉｅ邋ｓｐｏｔ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｐｒｏｂｅ邋ｏｆ邋Ｐ－Ｌｇ邋６６＃邋（０．５邋ｍｇ／ｍＬ）逡逑—Ｂ逡逑圖１－４邋Ｌｆ鼠單抗７５＃邋（０．５邋ｍｇ／ｍＬ）點(diǎn)樣一致性掃描圖逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－４邋Ｔｈｅ邋ｉｍａｇ
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R155.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2566771