發(fā)布時間：2019-11-23 15:13

【摘要】：鉛是最常見的環(huán)境重金屬污染物之一,嚴重威脅著人類的生存和健康。鉛具有明顯的雄性生殖毒性,能夠?qū)е滦坌跃訑?shù)量的減少,精子活性的降低。目前認為鉛能夠產(chǎn)生雄性生殖毒性的根本原因之一是：鉛能夠在睪丸細胞中蓄積從而持續(xù)地對睪丸造成損傷。因此,闡明鉛從睪丸細胞中排出的機制,減少睪丸細胞中鉛的蓄積,促進鉛的排出,將有利于防治鉛的雄性生殖毒性。多重耐藥相關蛋白1(Multidrug resistance associated protein 1, MRP1)最早被發(fā)現(xiàn)是由于其能夠?qū)⑦M入癌細胞中的抗癌藥物排出,進而使癌癥患者產(chǎn)生耐藥性。MRP1在機體組織中廣泛表達,尤其在肺、血.腦屏障、腎臟和睪丸中。近些年發(fā)現(xiàn),MRP1不但能夠轉(zhuǎn)運抗癌藥物還能夠轉(zhuǎn)運一些重金屬,如汞,鎘等。但MRP1與鉛轉(zhuǎn)運的關系尚不明確。之前的一些研究認為MRP1轉(zhuǎn)運重金屬的過程可能涉及還原型谷胱甘肽(Glutathione, GSH)。但是目前GSH參與MRP1轉(zhuǎn)運的具體機制尚不清楚。睪丸支持細胞是睪丸中的重要組成細胞。睪丸支持細胞之間能夠形成血-睪屏障結構,同時它能夠為輸精管中精子的生成提供代謝和結構的支持。因此睪丸支持細胞在生殖中起著重要的作用。本研究通過同源建模、分子虛擬篩選、慢病毒轉(zhuǎn)染RNAi構建穩(wěn)轉(zhuǎn)株等一系列方法探討MRP1和GSH在睪丸支持細胞鉛蓄積和外排中的作用及機制。研究發(fā)現(xiàn),睪丸支持細胞中鉛的蓄積和排出機制與MRP1和GSH有關。該研究將有助于預防和治療重金屬鉛對睪丸的損傷,進而推動我國公共衛(wèi)生事業(yè)的發(fā)展。目的：(1)通過構建小鼠MRP1的三維蛋白結構模型和分子虛擬篩選,查找出與MRP1結合能力較強的生物小分子,并判斷GSH與MRP1結合能力。(2)研究鉛對小鼠睪丸支持細胞株(TM4細胞)MRP1的表達及轉(zhuǎn)運活性的影響,初步探討TM4細胞中鉛與MRP1之間的關系。(3)通過慢病毒轉(zhuǎn)染技術構建MRP1穩(wěn)定低表達的TM4細胞,為探討MRP1在TM4細胞鉛轉(zhuǎn)運中的作用提供技術支持。(4)探討MRP1和GSH在TM4細胞鉛排出和蓄積中的作用,為有效地預防重金屬鉛的雄性生殖毒性提供實驗依據(jù)。方法：(1)小鼠MRP1蛋白的同源建模和分子對接通過在線服務器TMpred和ID Protein Structure Prediction Server分別對小鼠的MRP1的蛋白跨膜區(qū)域以及蛋白的二級結構進行分析。同時,利用SYBYL軟件進行同源建模和分子對接。通過搜索模板、同源識別、序列比對、構建模型保守區(qū)域、構建可變循環(huán)區(qū)域、添加側鏈及優(yōu)化模型一系列步驟對小鼠MRP1的蛋白三維結構進行構建。通過SYBYL軟件以及ProSA網(wǎng)站對構建的MRP1結構模型進行評價。通過SYBYL軟件計算并搜索MRP1三維結構中可能的小分子結合區(qū)域(口袋結構)。最后基于分子對接的方法,對ZINC庫中180313種化合物進行虛擬篩選,列出與MRP1蛋白結合能力較強的化合物,并判斷GSH與MRP1結合能力。(2)細胞存活率檢測以每孔1×105個細胞接種TM4細胞于96孔板中,在培養(yǎng)基中分別加入不同濃度的醋酸鉛和各種抑制劑(MK571、BSO、EA、NaN3)培養(yǎng)24h,用CCK8試劑盒檢測細胞的存活率。由此篩選本研究中所用醋酸鉛以及各種抑制劑的處理濃度。(3) MRP1轉(zhuǎn)運活性檢測分別在細胞培養(yǎng)液中加入不同濃度的MRP1活性特異性抑制劑MK571和鉛,用酶標儀測定MRP1的轉(zhuǎn)運底物Calcein和SNARF-1的熒光強度,以觀察TM4細胞中MRP1轉(zhuǎn)運活性。(4)檢測鉛對小鼠TM4細胞MRP1表達水平的影響體外培養(yǎng)小鼠睪丸支持細胞系TM4細胞；利用RT-qPCR和Western blot方法檢測TM4細胞MRP1 mRNA和蛋白表達水平；觀察不同濃度、不同時間鉛處理對TM4細胞內(nèi)MRP1表達的影響。(5)慢病毒干擾構建穩(wěn)定低表達MRP1的TM4細胞構建含有MRP1 shRNAs靶序列的穿梭質(zhì)粒,將穿梭質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至293T細胞內(nèi)培養(yǎng),收集慢病毒并進行病毒滴度檢測。將含有目的靶基因的病毒液侵染TM4細胞,通過檢測GFP熒光表達測侵染效率。RT-qPCR與Western blot法驗證MRP1表達抑制率,通過兩種MRP1轉(zhuǎn)運底物Calcein和SNARF-1驗證MRP1轉(zhuǎn)運活性抑制率。用嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定低表達MRP1的細胞株(本研究中簡稱TM4-sh細胞)(6)細胞內(nèi)鉛蓄積情況的檢測以0-100μM醋酸鉛分別處理TM4和TM4-sh細胞12h和24h,原子吸收光譜儀檢測各濃度組細胞中鉛含量。分析隨著醋酸鉛處理濃度的增加,TM4細胞和TM4-sh細胞中鉛的蓄積情況,并比較TM4細胞和TM4-sh細胞中鉛蓄積含量的差異。(7)細胞內(nèi)鉛排出情況的檢測分別在TM4和TM4-sh細胞培養(yǎng)基中加入終濃度20μM的醋酸鉛,培養(yǎng)24小時后,更換為無鉛培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。分別在更換無鉛培養(yǎng)基后的0、1、3、6、9、12h時間點時收集細胞。原子吸收光譜儀測定各時間點上細胞中的鉛殘留量,比較TM4細胞和TM4-sh細胞中鉛排出情況。類同的實驗過程觀察和分析MRP1活性抑制劑(MK571)、GSH生物合成抑制劑(BSO)、GST活性抑制劑(EA)和能量抑制劑(NaN3)對TM4細胞鉛排出的影響。(8)數(shù)據(jù)統(tǒng)計SPSS (version 17.0 for Windows, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理分析,每個實驗組實驗至少重復3次。用非配對t檢驗比較兩組間均數(shù)的差異；用ANOVA(Tukey's post hoc test)分析三組以及三組以上均數(shù)之間的差異。所得數(shù)據(jù)用nean±SD表示,P0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。結果：(1)小鼠MRP1蛋白的同源建模與基于分子對接的虛擬篩選通過SYBYL軟件對小鼠的MRP1蛋白進行同源建模,并對構建的模型進行優(yōu)化,然后繪制出小鼠MRP1蛋白的三維結構。并通過Ramchandran (Psi-Phi)和ProSA網(wǎng)站對構建的MRP1結構模型進行評價,結果顯示構建的蛋白結構模型中幾乎所有的氨基酸殘基(97.55%)均位于可接受的范圍內(nèi)；通過對模型的能量進行分析發(fā)現(xiàn),構建的蛋白模型中保守區(qū)域的能量較低,說明模型的保守區(qū)域相對穩(wěn)定。綜上結果說明本研究中構建的小鼠MRP1蛋白三維結構模型成功。將ZINC的生物合成小分子庫中的180313個小分子化合物分別與MRP1進行基于分子對接的虛擬篩選,并列出與MRP1對接總評分前十的化合物。結果發(fā)現(xiàn)GSH與MRP1的對接總評分為9.448,位居第八。GSH是與MRP1對接評分前十的化合物中唯一含有巰基的化合物,它被認為在MRP1轉(zhuǎn)運重金屬的過程中發(fā)揮著重要的作用,該結果也為探索GSH參與MRP1轉(zhuǎn)運底物的機制提供了基于結構的理論基礎。(2)TM4細胞具有MRP1的轉(zhuǎn)運活性,鉛能夠誘導MRP1轉(zhuǎn)運活性的增加在TM4細胞中加入0-100μM劑量濃度范圍內(nèi)的MRP1的活性抑制劑(MK571),檢測Calcein和SNARF-1的熒光強度。結果顯示MK571能夠劑量依賴性的增加TM4細胞內(nèi)Calcein和SNARF-1的含量,即加入MRP1活性抑制劑MK571后,細胞中殘留的MRP1轉(zhuǎn)運底物含量增加。該結果說明TM4細胞具有MRP1的轉(zhuǎn)運活性。在TM4細胞中加入一定濃度范圍的醋酸鉛,觀察到隨著加入醋酸鉛濃度的增加,細胞內(nèi)殘留的Calcein和SNARF-1的量下降,并呈劑量依賴關系。該結果表明鉛能夠誘導TM4細胞中MRP1的轉(zhuǎn)運活性。(3)鉛能夠誘導小鼠中MRP1的mRNA與蛋白表達水平的改變在TM4細胞中分別加入0-100pM的醋酸鉛,細胞存活率呈先上升后下降的趨勢,且當加入的醋酸鉛濃度達到100μM時,細胞的存活率只有54%(P0.05)。隨著給予鉛濃度的增加,MRP1 mRNA表達水平呈先升高后降低的趨勢,且與對照組(OμM組)相比,給予20、40和80μM的醋酸鉛,MRP1 mRNA表達分別相對增高了7、10和7倍,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。以20μM醋酸鉛分別處理TM4細胞3、6、12、24和48小時,結果顯示鉛處理超過24小時后,MRP1 mRNA的表達水平顯著增加(P0.05)。時間和劑量曲線顯示MRP1蛋白表達水平變化趨勢與mRNA水平變化趨勢一致,然而蛋白水平變化的倍數(shù)沒有mRNA改變的明顯。(4)通過慢病毒轉(zhuǎn)染技術成功構建了穩(wěn)定低表達MRP 1的TM4細胞根據(jù)基因庫小鼠MRP1基因(Gene ID:NM 008576.3)序列,設計4個靶點干擾序列,采用慢病毒載體技術構建穩(wěn)定低表達MRP1的TM4細胞4個候選株。根據(jù)RT-qPCR和Western blot驗證,結果確定出MRP1表達敲低效果最為明顯的一株,并命名為TM4-sh細胞。RT-qPCR和Western blot的結果顯示：TM4-sh細胞中MRP1的mRNA和蛋白表達均較TM4細胞分別降低了73%和75%,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。MRP1的特異轉(zhuǎn)運底物SNARF-1和Calcein在TM4-sh細胞內(nèi)未轉(zhuǎn)運量較TM4細胞顯著增加(P0.01),且TM4-sh細胞中的SNARF-1未轉(zhuǎn)運量高出TM4細胞350%。這些結果證實本研究中構建的TM4-sh細胞被有效地敲低了MRP1基因表達和轉(zhuǎn)運活性。(5)鉛在TM4-sh細胞中的蓄積量顯著高于TM4細胞,且鉛的蓄積與鉛處理濃度呈現(xiàn)劑量依賴關系。以0-100μM醋酸鉛分別培養(yǎng)TM4和TM4-sh細胞,在12和24小時后,檢測各濃度組細胞中的鉛含量。結果顯示隨著鉛濃度增加,細胞內(nèi)的鉛蓄積量明顯增加(P0.05)。與TM4細胞組相比,TM4-sh細胞中的鉛蓄積更加明顯；尤其以10-40μM的醋酸鉛處理細胞12和24小時后,TM4-sh細胞中的鉛含量較TM4細胞中高出2到8倍(P0.05)。(6)敲低TM4細胞的MRP1表達水平或抑制MRP1活性能顯著延緩細胞內(nèi)鉛的排出根據(jù)細胞存活率和預實驗結果,以20μM醋酸鉛分別處理TM4和TM4-sh細胞24小時,然后更換為無鉛培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)0、1、3、6、9和12小時。收集各時間點細胞,檢測細胞內(nèi)鉛殘留量,結果以0時間點細胞內(nèi)鉛含量的百分比表示。結果顯示更換為無鉛培養(yǎng)基1小時后,TM4-sh細胞內(nèi)仍然殘留有75.0%的鉛,較同時間點TM4細胞鉛高出41.8%。在隨后的3、6、9h時點, TM4-sh細胞內(nèi)持續(xù)顯示含有較高的鉛殘留量,且較TM4細胞平均高出23.4%(包括1h時點),各時點差異均有統(tǒng)計學意義,P0.05。同樣以20μM醋酸鉛處理TM4細胞24h后,更換含MRP1活性抑制劑(MK571)的無鉛培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)0、1、3、6、9和12小時,MK571組在第3-12小時各點細胞內(nèi)鉛的相對殘留量均高于對照組(P0.05)。(7)GSH和GST參與TM4細胞鉛排出,且鉛排出依賴ATP加入1mM的ATP的抑制劑(NaN3)培養(yǎng)24小時與對照組(0mM的NaN3)相比細胞內(nèi)ATP含量顯著降低(P0.01)。加入NaN3組,細胞中ATP含量只有對照組的48.7%。加入25μM GSH的抑制劑(BSO)培養(yǎng)24小時,較對照組(0μMBSO)相比細胞內(nèi)GSH含量顯著降低(P0.01),且只有對照組細胞中GSH含量的52.3%；加入50μM GST的抑制劑(EA)后,與對照組(OμM EA)相比細胞中GST活性顯著降低(P0.01),只有對照組細胞中的GST活性的28.7%。TM4細胞經(jīng)20μM醋酸鉛培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時后,棄掉舊培養(yǎng)基,分別換用含有或不含有GSH合成抑制劑BSO、GST活性抑制劑EA和能量抑制劑NaN。的無鉛培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),并分別在更換培養(yǎng)基后第0、1、3、6、9和12小時收集細胞,原子吸收分光光度法檢測細胞內(nèi)鉛殘留量。在同一處理組內(nèi),隨著排鉛時間的延長,各處理組鉛的相對殘留量呈現(xiàn)先急后緩的下降趨勢,其中第0小時至第3小時內(nèi)降速明顯,3小時后降速緩慢。在排鉛的第1-9小時各時點,NaN。組細胞中鉛相對殘留量顯著高于對照組(不含NaN3組),P0.01；在排鉛的第3-12小時各時點,BSO組細胞內(nèi)鉛相對殘留量均高于對照組(不含BSO組),P0.01；在排鉛的第3和9小時時點上,EA組細胞內(nèi)鉛的相對殘留量也均高于對照組(不含EA組),P0.05。這些結果說明GSH含量的降低、抑制GST活性和抑制細胞需要的能量都不利于TM4細胞內(nèi)鉛的外排。結論：(1)MRP1蛋白三維結構與GSH具有較強的結合力。因此,MRP1可能具有轉(zhuǎn)運GSH結合物的結構基礎。(2)TM4細胞具有MRP1的轉(zhuǎn)運活性,鉛能夠影響TM4細胞中MRP1的轉(zhuǎn)運活性。且鉛能夠誘導TM4細胞中MRP1的mRNA和蛋白表達水平的改變。(3)本研究通過慢病毒干擾技術成功構建了穩(wěn)定低表達MRP1的TM4細胞(TM4-sh)。TM4-sh細胞中MRP1的mRNA和蛋白表達水平顯著降低,且MRP1的轉(zhuǎn)運活性也被明顯抑制。(4)敲低TM4細胞的MRP1表達水平或抑制其活性能夠顯著增加鉛在細胞中蓄積,并延緩細胞內(nèi)鉛的排出。GSH含量的降低、抑制GST活性或者抑制細胞需要的能量都不利于TM4細胞內(nèi)鉛的外排。因此,MRP1參與了TM4細胞鉛轉(zhuǎn)運,且依賴于ATP和GSH。
【圖文】：

同源建模過程包含六個步驟；（１）搜索模板，同源識別；（２）調(diào)整目標序逡逑列的模板結構，序列比對；（３）構建模型保守區(qū)域；（４）構建可變循環(huán)區(qū)域；逡逑（５）添加側鏈，，優(yōu)化模型；（６）評估模式。見流程圖１－１。逡逑ｊ邐Ｔａｒｇ＂邋Ｓ邋巧邋ｕｅｎｃａ邐ＴｓｍｐｌａｔＢ邋Ｓｔｍｃ邋山？逡逑

本文編號：2565015