【摘要】：益生菌具有多種生理功能，被廣泛應(yīng)用于食品及醫(yī)藥領(lǐng)域，新型菌種的出現(xiàn)也加快了益生菌產(chǎn)業(yè)化的進(jìn)程，同時(shí)益生菌的安全性問題引起了廣大學(xué)者關(guān)注，大多數(shù)的益生菌在長(zhǎng)期的使用過程中被認(rèn)為是相對(duì)安全的，但是近年來許多菌屬從人的感染性損傷組織中分離出來，并且也出現(xiàn)服用益生菌制品所導(dǎo)致的病例，這使得益生菌的安全性成為一個(gè)不容忽視的問題，引起了人們對(duì)益生菌安全性的重新認(rèn)識(shí)。 目的：保加利亞桿菌、嗜熱鏈球菌和嗜酸乳桿菌是乳制品中常用的三種益生菌，本文采用體外Caco-2細(xì)胞模型方法考察這三種常用乳制品益生菌對(duì)腸道屏障功能的影響，探討這三種菌是否存在潛在的安全性問題。 方法：保加利亞桿菌、嗜熱鏈球菌和嗜酸乳桿菌的活化培養(yǎng)，調(diào)整益生菌的濃度為102-108cfu/mL，分別與Caco-2細(xì)胞共培養(yǎng)，用MTT比色法考察這三種菌對(duì)Caco-2細(xì)胞的毒性作用，計(jì)算本實(shí)驗(yàn)條件下三種益生菌的IC50，將同一濃度三種益生菌按照1:1:1比例混合并計(jì)算混合菌的IC50；益生菌以108cfu/mL的濃度與分化的Caco-2細(xì)胞共培養(yǎng)48h，，ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞因子IL-1β、IL-10、TNF-α和IFN-γ的分泌；建立Caco-2單層細(xì)胞模型，益生菌以108cfu/mL的濃度與單層模型共培養(yǎng)24h，酶標(biāo)儀檢測(cè)酚紅的透過率，透射電鏡觀察細(xì)胞模型的緊密連接結(jié)構(gòu)；益生菌以108cfu/mL的濃度與Caco-2細(xì)胞共培養(yǎng)24h，通過免疫熒光法標(biāo)記Caco-2細(xì)胞的β-微管蛋白，在激光共聚焦顯微鏡下觀察；益生菌以108cfu/mL的濃度與Caco-2細(xì)胞共培養(yǎng)24h，western blot分析Caco-2細(xì)胞緊密連接蛋白Occludin的表達(dá)。 結(jié)果：保加利亞桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌和混合菌在較低濃度時(shí)（≤104cfu/mL）對(duì)Caco-2細(xì)胞的增殖無顯著影響，未表現(xiàn)出細(xì)胞毒性作用，當(dāng)這三種益生菌的濃度≥105cfu/mL時(shí)，可顯著的抑制Caco-2細(xì)胞（結(jié)腸癌細(xì)胞）增殖，當(dāng)濃度≥107cfu/mL時(shí)，三種益生菌對(duì)Caco-2細(xì)胞表現(xiàn)出了細(xì)胞毒性作用，并計(jì)算得出了三種益生菌在本實(shí)驗(yàn)條件下的的半數(shù)抑制濃度（IC50），保加利亞桿菌IC50=1.19108cfu/mL、嗜酸乳桿菌IC50=3.93108cfu/mL、嗜熱鏈球菌IC50=2.02108cfu/mL，混合菌IC50=3.93108cfu/mL益生菌對(duì)體外培養(yǎng)的Caco-2細(xì)胞無聯(lián)合毒性作用；保加利亞桿菌、嗜熱鏈球菌和嗜酸乳桿菌（108cfu/mL）作用于Caco-2細(xì)胞48h后，細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、IFN-γ及IL-10分泌無影響；保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌（108cfu/mL）作用于Caco-2細(xì)胞單層模型24h、48h、72h后，對(duì)Caco-2細(xì)胞單層模型酚紅透過率無影響，嗜熱鏈球菌（108cfu/mL）作用于72h后，顯著增加了Caco-2細(xì)胞單層酚紅透過率，三種益生菌作用24h后，在透射電鏡下觀察緊密連接結(jié)構(gòu)完好，未出現(xiàn)異常變化，保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌單獨(dú)作用未對(duì)細(xì)胞單層的緊密連接結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞性的影響；保加利亞桿菌、嗜熱鏈球菌和嗜酸乳桿菌（108cfu/mL）與Caco-2細(xì)胞共培養(yǎng)24h，對(duì)細(xì)胞骨架蛋白β-tublin無影響；保加利亞桿菌、嗜熱鏈球菌和嗜酸乳桿菌（108cfu/mL）與Caco-2細(xì)胞共培養(yǎng)24h，Caco-2細(xì)胞的緊密連接蛋白Occludin表達(dá)無影響。結(jié)論：體外Caco-2細(xì)胞試驗(yàn)表明，三種常用的乳制品益生菌并未對(duì)腸道屏障功能產(chǎn)生不良影響，不存在潛在的安全性問題。
【圖文】：

2.1.2.3.2 三種益生菌聯(lián)合作用將處于同一濃度級(jí)別的三種益生菌按照 1:1:1 的比例進(jìn)行混合，各組菌濃度分別為 102、103、104、105、106、107、108cfu/mL，用 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活性，具體操作方法同上。2.1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 SPSS13.0 分析，方差分析采用 LSD 法（方差齊性）和 Dunnett’s法（方差非齊性），檢驗(yàn)水準(zhǔn) α=0.05。2.2 結(jié) 果2.2.1 顯微鏡下觀察 Caco-2 細(xì)胞的形態(tài)Caco-2 細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇培養(yǎng)后，狀態(tài)良好，下圖（圖 2.1）為所培養(yǎng)細(xì)胞情況。每隔 1-3 天換液一次。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到 70 %-80 ％融合時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞傳代。消化后的細(xì)胞呈圓形，且分散均勻。

嗜熱鏈球菌（1000×） 嗜熱鏈球菌（1000×）圖 2.3 顯微鏡下觀察經(jīng)革蘭氏染色后的益生菌Fig.2.3 Morphologic observation of probiotics stained by Gram's method2.2.4 益生菌的生長(zhǎng)曲線2.2.4.1 保加利亞乳桿菌生長(zhǎng)曲線保加利亞乳桿菌生長(zhǎng)狀況良好，隨著時(shí)間的增加，OD 值逐漸增大，細(xì)菌的數(shù)量增多，在 4-12 小時(shí)之間，細(xì)菌數(shù)迅速增大，20 小時(shí)后細(xì)菌的數(shù)量趨于穩(wěn)定。見圖 2.4
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R151

【引證文獻(xiàn)】

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1 雷虹;王麗麗;孫夢(mèng)媛;付斌;平文祥;;Lb.paracasei HD1.7對(duì)小鼠免疫能力的調(diào)節(jié)作用[J];黑龍江大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào);2013年02期

本文編號(hào)：2523470