【摘要】：目的：本研究旨從細(xì)胞和整體水平研究miR-23b調(diào)控BDE47誘導(dǎo)CYP3A1表達(dá)、活性及功能的重要作用及分子機(jī)制,為深入闡述BDE47的生物毒效應(yīng)及健康危害,并為環(huán)境污染物的健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。 方法：首先利用表達(dá)CYP3A1酶的大鼠H4ⅡE細(xì)胞株,通過(guò)CCK-8. Western Blot、 siRNA干擾、CYP3A誘導(dǎo)劑(地塞米松,DEX)處理和免疫熒光等試驗(yàn)確定BDE47的毒性劑量及BDE47對(duì)CYP3A1的誘導(dǎo)作用。然后通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和real-time PCR驗(yàn)證,進(jìn)一步確認(rèn)目標(biāo)mcroRNA (miR-23b),在此基礎(chǔ)上,運(yùn)用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)明確miR-23b和CYP3A1(大鼠)/CYP3A4(人)的靶向關(guān)系。然后利用microRNA的功能實(shí)驗(yàn)(miR-23b過(guò)表達(dá)和抑制表達(dá)試驗(yàn))驗(yàn)證miR-23b對(duì)CYP3A1/CYP3A4的調(diào)控作用。最后通過(guò)Lenti viral-anti-miR-23b漫病毒和BDE47聯(lián)合處理大鼠,檢測(cè)動(dòng)物樣本miR-23b水平、CYP3A1表達(dá)水平和活性變化,以及GC-MS檢測(cè)樣本BDE47原形和代謝產(chǎn)物的含量,進(jìn)一步驗(yàn)證niR-23b在調(diào)控BDE47誘導(dǎo)CYP3A表達(dá)及其功能中的重要作用。 結(jié)果： 1.不同濃度的BDE47處理H4IIE細(xì)胞,可引起細(xì)胞活力呈劑量依賴(lài)性下降,DEX(CYP3A1誘導(dǎo)劑)預(yù)處理可明顯增強(qiáng)BDE47所致的細(xì)胞毒性；CYP3A1-siRNA轉(zhuǎn)染H4IIE細(xì)胞后,BDE47(20μM)的細(xì)胞毒性明顯下降。免疫熒光及Western Blot實(shí)驗(yàn)顯示,BDE47可以顯著誘導(dǎo)CYP3A1的表達(dá)。 2.利用生物信息學(xué)軟件(miRanda-mirSVR、miRBase19、RNAhybrid、miRecords和PITA)初步確認(rèn)了miR-23b可能與CYP3A的調(diào)控表達(dá)有關(guān),研究結(jié)果顯示,BDE47處理的細(xì)胞及BDE47染毒的大鼠肝臟組織中,miR-23b都顯著下降。 3.報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示,miR-23b可以分別和大鼠CYP3A1的3'UTR和人CYP3A4的CDS結(jié)合發(fā)揮調(diào)控作用,miRNA結(jié)合大鼠CYP3A1位點(diǎn)在3'UTR(+1620-+2790),而在人CYP3A4的CDS區(qū)的具體作用位點(diǎn),分別位于(+450-+750)、(+1150-+1400)、(+1490-+1710)。 4. miR-23b mimic轉(zhuǎn)染H4ⅡE細(xì)胞24h后,CYP3A1的表達(dá)下降,BDE47的細(xì)胞毒性顯著降低；而miR-23b inhibitor處理,則CYP3A1表達(dá)升高,BDE47的細(xì)胞毒性顯著增強(qiáng)。 5.特異性抑制：miR-23b表達(dá)的micro-down'漫病毒和BDE47聯(lián)合處理大鼠,大鼠肝臟1niR-23b表達(dá)顯著減少,而CYP3A1蛋白表達(dá)和活性顯著升高；通過(guò)GC-MS檢測(cè)發(fā)現(xiàn),抑制miR-23b表達(dá)后,BDE47染毒大鼠的血清和肝臟中BDE47原形的含量顯著下降,而血清中3種BDE47的代謝產(chǎn)物3-OH-BDE47、4'-OH-BDE49和4-OH-BDE42都顯著增加,但肝臟中的BDE47代謝產(chǎn)物未見(jiàn)明顯改變。 結(jié)論： 1.BDE47能夠誘導(dǎo)H4ⅡE細(xì)胞CYP3A1的表達(dá),BDE47可通過(guò)誘導(dǎo)CYP3A1的表達(dá)而增強(qiáng)其毒效應(yīng)。 2.證實(shí)：niR-23b與CYP3A的互補(bǔ)關(guān)系及結(jié)合靶點(diǎn)(大鼠CYP3A1的3’UTR和人CYP3A4的CDS區(qū)域),提出miR-23b可能在CYP3A的調(diào)控中發(fā)揮重要作用； 3.細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)了miR-23b可調(diào)節(jié)CYP3A1的表達(dá),miR-23b可以通過(guò)調(diào)控CYP3A1表達(dá)及活性而影響B(tài)DE47的代謝并進(jìn)而影響其毒效應(yīng)。
[Abstract]:Objective: the purpose of this study was to study the important role and molecular mechanism of miR-23b regulating the expression, activity and function of CYP3A1 induced by BDE47 at the cellular and overall level, so as to provide theoretical basis and technical support for further expounding the biological toxic effects and health hazards of BDE47, and providing theoretical basis and technical support for health risk assessment of environmental pollutants. Methods: first, the rat H4 鈪，

本文編號(hào)：2499262