【摘要】：研究目的：二硫化碳(carbon disulfide, CS2)是一種常見有機(jī)溶劑,廣泛應(yīng)用于人造絲、玻璃紙、殺蟲劑、四氯化碳等的生產(chǎn)加工。職業(yè)暴露于CS2可引起作業(yè)工人神經(jīng)系統(tǒng)功能損傷,主要表現(xiàn)為周圍神經(jīng)病。本研究利用CS2灌胃染毒建立大鼠中毒性周圍神經(jīng)病模型,透射電鏡觀察脊髓組織和坐骨神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)的損傷,速率法測定血清中肌酸激酶(CK)活性,Western blotting法檢測大鼠脊髓和坐骨神經(jīng)中自噬相關(guān)蛋白及其調(diào)控信號蛋白的相對含量,描述CS2中毒性周圍神經(jīng)病大鼠神經(jīng)組織中自噬蛋白的變化情況,以研究神經(jīng)元自噬改變與周圍神經(jīng)病的關(guān)系,探討CS2中毒性周圍神經(jīng)病的分子機(jī)制。 研究方法： 1.建立Wistar大鼠CS2中毒性周圍神經(jīng)病模型 健康雄性Wistar大鼠80只,體重280～300g,經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)7天后隨機(jī)分為對照組、200、400和600mg/kgCS2染毒組,每組20只。用玉米油作溶劑配制不同濃度CS2溶液,2ml/kg灌胃Wistar大鼠,對照組灌胃等體積的玉米油,6次/周,持續(xù)6周。每周兩次稱量體重,一次測定大鼠前肢、四肢抓力以及甩尾實(shí)驗(yàn)時(shí)間,每天注意觀察大鼠步態(tài)、震顫現(xiàn)象并予以記錄。染毒結(jié)束后,大鼠斷頭處死,取脊髓、坐骨神經(jīng)及血清,-80℃保存?zhèn)溆谩?2.透射電鏡觀察脊髓和坐骨神經(jīng)病理改變 染毒終點(diǎn)時(shí),各組分取兩只大鼠,烏拉坦麻醉后取坐骨大孔下坐骨神經(jīng)2-3cm,戊二醛灌注固定后取胸腰段脊髓,取下的坐骨神經(jīng)及脊髓組織經(jīng)固定、脫水、包埋、切片、染色后,透射電鏡觀察、攝片。 3.速率法測定大鼠血清中肌酸激酶(CK)活性 使用肌酸激酶測定試劑盒,全自動生化分析儀進(jìn)行測定,得出各組血清樣品中肌酸激酶活性數(shù)值。 4Western blotting法測定大鼠脊髓組織和坐骨神經(jīng)中自噬相關(guān)蛋白和信號通路蛋白的相對含量 脊髓組織按質(zhì)量體積比1∶5加入預(yù)冷的含有TritonX-100、蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的勻漿液；坐骨神經(jīng)先在液氮中研成粉末,然后按質(zhì)量體積比1∶5加入上述預(yù)冷勻漿液。以上組織在冰水浴中勻速勻漿,4℃20,000×g離心60min。取上清裝入Eppendorf管中,經(jīng)BCA法蛋白定量后,Western blotting法測定自噬相關(guān)蛋白和信號通路蛋白的相對含量。 研究結(jié)果： 1.CS2染毒對大鼠體重的影響：實(shí)驗(yàn)過程中,對照組動物體重穩(wěn)步上升；200、400和600mg/kg CS2染毒組體重分別從第3周、第2周、第2周開始與對照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),至實(shí)驗(yàn)結(jié)束,各染毒組大鼠體重分別為對照組的89.6%、78.3%、64.6%,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2.CS2染毒大鼠亞慢性中毒情況：CS：染毒后,400和600mg/kgCS2組大鼠表現(xiàn)為步態(tài)異常,活動減少,肌張力降低,精神狀態(tài)差等。隨染毒劑量的增加,癥狀逐漸加重。染毒第3周,600mg/kgCS2染毒組步態(tài)出現(xiàn)異常(P＜0.05),至實(shí)驗(yàn)結(jié)束,1/3的動物癱瘓,完全不能支持體重、足后翻、前行困難,被評為4分。染毒第4周,400mg/kgCS2染毒組步態(tài)出現(xiàn)異常,至實(shí)驗(yàn)結(jié)束,1/3動物被評為3分。200mg/kg CS2染毒組整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中中毒表現(xiàn)不明顯。此外,400和600mg/kgCS2染毒組分別于染毒第4周、第3周出現(xiàn)震顫,至實(shí)驗(yàn)結(jié)束,各組震顫發(fā)生比例分別為30%和65%。 3.CS2染毒對大鼠甩尾時(shí)間、前肢抓力、四肢抓力的影響：(1)整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中,染毒動物甩尾時(shí)間無明顯變化。(2)染毒前3周,各組大鼠前肢抓力呈上升趨勢,400和600mg/kgCS2染毒組分別在染毒第5周、第4周呈現(xiàn)下降趨勢,至實(shí)驗(yàn)結(jié)束,與對照組相比,分別下降10.3%、35.5%。染毒第5周、第6周,600mg/kgCS2染毒組前肢抓力與對照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。(3)染毒前3周,各組大鼠四肢抓力隨體重增加而增加。染毒第4周,600mg/kgCS2組大鼠四肢抓力開始下降,至染毒結(jié)束,下降了26.2%。染毒第5、6周,與對照組相比,600mg/kgCS2染毒組大鼠四肢抓力分別降低10.2%,25.7%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 4.CS2染毒對大鼠血清中肌酸激酶活性的影響：CS2染毒大鼠血清中肌酸激酶活性顯著降低。與對照組相比,200、400和600mg/kgCS2組分別降低了24.8%、41.1%和50.6%,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 5.CS2染毒大鼠電鏡觀察結(jié)果：染毒大鼠脊髓組織神經(jīng)元出現(xiàn)了溶酶體增多,暗神經(jīng)元和脫顆�，F(xiàn)象；坐骨神經(jīng)組織神經(jīng)纖維出現(xiàn)軸突與髓鞘輕度分離,軸突內(nèi)較多髓樣小體,髓鞘板層分離和軸突閉鎖現(xiàn)象。這些超微結(jié)構(gòu)的改變,提示CS2染毒引起了脊髓運(yùn)動神經(jīng)元的損傷。 6.CS2染毒對大鼠自噬相關(guān)蛋白的影響：在脊髓組織中,與對照組相比,染毒動物脊髓中LC3Ⅱ和LC3Ⅱ/Ⅰ、Atg1L顯著升高,而p62顯著降低。在坐骨神經(jīng)中,與對照組相比,染毒組LC3Ⅱ、LC3Ⅱ/Ⅰ、AtglL、Atg5、Atg12均顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)；600mg/kg染毒組Atg1H明顯降低,降低了36.0%；600mg/kgCS2組p62和Ambra1顯著上升,分別升高了23.7%、36.2%；400mg/kg、600mg/kg染毒組Beclinl明顯降低,分別降低20.3%、24.1%。 7.CS2染毒對大鼠Akt-mTOR-p70S6K信號通路的影響：脊髓組織中,與對照組相比,各染毒組p-Akt, p-mTOR顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Ak、mTOR、p70S6K、p-p70S6K無明顯變化。坐骨神經(jīng)中,與對照組相比,600mg/kgCS2染毒組p70S6K明顯降低,降低了27.1%；400mg/kg和600mg/kgCS2染毒組p-p70S6K明顯降低,分別降低了27.5%、25.5%,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而Akt、p-Akt無明顯變化。 結(jié)論： 1.CS2灌胃染毒能成功建立中毒性周圍神經(jīng)病動物模型。 2.CS2可引起中毒動物血清肌酸激酶活性發(fā)生改變。 3.CS2可引起中毒動物脊髓和坐骨神經(jīng)組織中自噬相關(guān)蛋白發(fā)生改變。 4.自噬干擾可能與CS2中毒性周圍神經(jīng)病的發(fā)生有關(guān)。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R114

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2456487