【摘要】：研究背景及目的 氟中毒(Fluorosis)是一種慢性全身性疾病，是由于長期生活在高氟環(huán)境中通過飲水、食物和空氣而攝入過量的氟，導(dǎo)致人體中氟元素蓄積。微量元素氟對人體健康的影響有其特殊性，適量時可以有效促進骨質(zhì)生長、降低齲病的發(fā)病率，過量時則引起氟中毒，使機體引起骨相和非骨相損害，從而引起氟斑牙、氟骨癥等牙齒和骨骼的病變，同時還能引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肝、腎以及內(nèi)分泌系統(tǒng)等多種器官的病理變化，但由于氟對骨組織具有特殊的親和力，使氟對骨相的損害較非骨相的損害更為敏感。氟引起的骨相損害中，氟斑牙是氟中毒最早出現(xiàn)、最顯而易見的特異性體征，嚴(yán)重?fù)p害牙齒的正常功能，又影響美觀。氟斑牙的病理變化復(fù)雜多樣，其形成是由于牙齒在礦化期階段，持續(xù)攝入過量的氟而引起的，但氟斑牙發(fā)病的具體分子生物學(xué)機制尚未充分闡明。 牙器官形成過程與成釉細胞密切相關(guān)，成釉細胞是對氟中毒最敏感的細胞，大量的研究提出氟斑牙形成的可能致病途徑是由于氟干擾成釉細胞的增殖、分化，加劇成釉細胞的凋亡；干擾成釉細胞中釉基質(zhì)的合成、分泌及移除。因此，成釉細胞是研究氟斑牙發(fā)病機制的重要研究對象，也是關(guān)鍵突破口。本實驗室曾通過建立氟斑牙的大鼠實驗動物模型，研究了氟對大鼠切牙成釉細胞凋亡、DNA損傷以及Fas表達的影響，但是成釉細胞如何在氟的毒理學(xué)作用下形成以氟斑牙為主要表現(xiàn)的氟骨相損害，其機制仍需深入探討。 近年來，在分子水平上廣泛研究了氟與氧化應(yīng)激和細胞凋亡的關(guān)系，氟中毒的損傷作用主要是通過對機體產(chǎn)生氧化應(yīng)激引起，而細胞凋亡在牙齒發(fā)育中起著重要作用，是導(dǎo)致氟對牙齒損害的關(guān)鍵因素之一。在細胞生長發(fā)育以及對外界刺激的反應(yīng)中細胞凋亡貫穿整個生物學(xué)發(fā)展過程，而氧化應(yīng)激又是凋亡發(fā)生的中心環(huán)節(jié)，是氟中毒誘導(dǎo)細胞凋亡的關(guān)鍵。新近的研究發(fā)現(xiàn)，作為核轉(zhuǎn)錄因子的NF-E2相關(guān)因子2(NF-E2-related factor2，Nrf2)和其胞質(zhì)接頭蛋白Keap1(Kelch-likeECH-associated protein1，Keap1)是細胞抗氧化應(yīng)激的中樞調(diào)節(jié)者，在抗氧化應(yīng)激方面起著關(guān)鍵作用。在機體受到氧化應(yīng)激損傷時，轉(zhuǎn)錄因子Nrf2能夠和抗氧化反應(yīng)元件(Antioxidant response element，ARE)結(jié)合，，對Nrf2下游存在的一系列的Ⅱ相解毒酶基因，如血紅素氧合酶-1(Hemeoxygenase-1，HO-1)、醌氧化還原酶1(NAD(P)H dehydrogenase quinone1，NQO1)等抗氧化酶基因進行調(diào)控及誘導(dǎo)，從而增強機體的抗氧化應(yīng)激能力。 本研究利用體外培養(yǎng)小鼠成釉細胞株，以氟引起小鼠成釉細胞氧化損傷為基礎(chǔ)，開展氟對氧化應(yīng)激、DNA損傷、細胞增殖與凋亡以及對Nrf2信號通路的作用研究。檢測氟對成釉細胞氧化應(yīng)激，DNA損傷，Nrf2、HO-1、NQO1的基因和Nrf2蛋白的表達，細胞增殖與凋亡的影響，探討Nrf2信號通路在氟致成釉細胞損害中的作用，從而為深入研究氟斑牙發(fā)病機制提供新的實驗證據(jù)。既然氧化應(yīng)激被普遍認(rèn)為是氟中毒的重要機理，因此，探討抗氧化劑的抗氧化作用在氟中毒防治中是至關(guān)重要的。本課題還將研究以枸杞多糖、原花青素、硒、鋅為代表的抗氧化劑對氟誘導(dǎo)成釉細胞DNA損傷的保護作用，探索氟中毒的防治措施。 本研究主要由以下3部分組成： 第一部分：氟對小鼠成釉細胞氧化應(yīng)激、細胞增殖與凋亡的作用研究目的：探討氟對小鼠成釉細胞存活率的影響，確定后續(xù)實驗的氟染毒劑量。觀察不同劑量的氟對小鼠成釉細胞氧化應(yīng)激、DNA損傷、細胞周期和凋亡的影響。方法：建立并改良小鼠成釉細胞株的培養(yǎng)方法，應(yīng)用四唑鹽(MTT)比色法，觀察氟對培養(yǎng)的成釉細胞增殖活力的影響；測定小鼠成釉細胞丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活性；用單細胞凝膠電泳技術(shù)(SCGE)和酶聯(lián)免疫實驗(ELISA)檢測氟對成釉細胞DNA的損傷；用流式細胞術(shù)(FCM)檢測氟對成釉細胞的細胞周期變化及凋亡的改變。 結(jié)果：改良后細胞培養(yǎng)方法重復(fù)性好，成釉細胞生長穩(wěn)定，純化效果好，完全適合建立氟中毒的體外模型。氟對成釉細胞有一定的細胞毒性，隨著染氟劑量的升高，細胞的存活率逐漸降低，SOD的活性逐漸下降，GSH-Px的活性被抑制，MDA含量增加；DNA損傷結(jié)果顯示，除染氟劑量為0.25mmol/L時，隨著染氟劑量的升高，各劑量組氟造成的細胞DNA彗星樣尾長、Olive尾距、尾DNA%及尾/頭長比與對照組相比均明顯增加。其中尾長、Olive尾距在0.50、1.00、4.00mmol/L染氟劑量時與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。除染氟劑量為2.00mmol/L外，其他組隨著染氟劑量的升高，8-OHdG含量逐漸升高，其中在染氟劑量為0.50，1.00，4.00mmol/L時，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。染氟劑量為2.00mmol/L時，與對照組比較，小鼠成釉細胞G0/G1細胞構(gòu)成比升高，G2/M細胞構(gòu)成比升高，S期細胞構(gòu)成比下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；其余各組小鼠成釉細胞G0/G1、G2/M、S期細胞構(gòu)成比與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。小鼠成釉細胞的凋亡率在染氟劑量為4.00mmol/L時，與對照組相比，凋亡率升高(P0.05)。 結(jié)論：氟在一定劑量條件下抑制小鼠成釉細胞的增殖，過量氟能使小鼠成釉細胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，同時導(dǎo)致成釉細胞DNA損傷，一定劑量的氟使細胞停滯于S期，降低細胞活力，改變細胞周期的分布，并誘導(dǎo)細胞凋亡。 第二部分：氟對小鼠成釉細胞Nrf2信號通路的影響 目的：在基因轉(zhuǎn)錄、翻譯和蛋白表達水平，觀察不同劑量的氟處理和特丁基對苯二酚(Tertiary butylhydroquinone，tBHQ)誘導(dǎo)后成釉細胞HO-1、NQO1、Nrf2mRNA和Nrf2蛋白的表達水平，探討Nrf2信號通路和tBHQ對氟誘導(dǎo)的成釉細胞毒性的作用。 方法：RT-PCR法測定成釉細胞HO-1、NQO1、Nrf2mRNA的表達；Western-Blot法測定成釉細胞Nrf2蛋白含量。 結(jié)果：單獨染氟組，成釉細胞內(nèi)Nrf2mRNA和Nrf2蛋白表達隨氟劑量的升高逐漸增強。只有1.00和4.00mmol/L染氟組細胞內(nèi)Nrf2mRNA表達與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；各染氟組HO-1mRNA表達都比對照組高，只有在0.50、1.00、2.00和4.00mmol/L劑量組與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。除在4.00mmol/L劑量組外，其余染氟組NQO1mRNA表達量都比對照組高，但只有在1.00mmol/L劑量組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。在0.25、2.00mmol/L染氟劑量組，細胞漿內(nèi)Nrf2蛋白與對照組相比表達有所增加(P0.05)。細胞核內(nèi)Nrf2蛋白在2.00、4.00mmol/L染氟劑量時表達上調(diào)(P0.05)。經(jīng)tBHQ預(yù)處理后，各組Nrf2、HO-1、NQO1mRNA和細胞漿、細胞核中Nrf2蛋白表達與同劑量染氟tBHQ未處理組相比均升高。在0.00、0.25、0.50、2.00、4.00mmol/L染氟劑量，Nrf2mRNA與同劑量染氟tBHQ未處理組相比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。各組HO-1mRNA表達都比同劑量染氟tBHQ未處理組高，只有在0.00、0.50、和4.00mmol/L染氟組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。各組NQO1mRNA表達都比同劑量染氟tBHQ未處理組高，只有在0.25、4.00mmol/L染氟組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。在染氟劑量為0.25、1.00、2.00、4.00mmol/L時，tBHQ處理組核漿內(nèi)Nrf2蛋白比值與tBHQ處理對照組(0.00mmol/L NaF)相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)，且呈升高趨勢。在染氟劑量為0.00、0.50、4.00mmol/L時，tBHQ處理組與tBHQ未處理組核漿內(nèi)Nrf2蛋白比值相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論：一定劑量的氟作用成釉細胞后可誘導(dǎo)Nrf2基因和蛋白的表達，進而使Nrf2信號通路下游II相抗氧化酶基因HO-1和NQO1表達增加；tBHQ可誘導(dǎo)成釉細胞HO-1、NQO1、Nrf2mRNA的表達增強，能夠在一定程度上拮抗氟對成釉細胞的毒性作用，對細胞具有保護作用。 第三部分：抗氧化劑對氟致小鼠成釉細胞DNA損傷的研究 目的：研究枸杞多糖、原花青素、硒、鋅分別與氟聯(lián)合作用對小鼠成釉細胞DNA損傷的影響。 方法：成釉細胞貼壁培養(yǎng)24h后換液并加入不同劑量的抗氧化劑：枸杞多糖(100mg/L、200mg/L、400mg/L)、原花青素(10mg/L、25mg/L、50mg/L)、亞硒酸鈉(2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L)、硫酸鋅(5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L)，處理相應(yīng)時間后換液，加入不同劑量的氟處理細胞，然后收集細胞采用單細胞凝膠電泳技術(shù)檢測DNA單鏈斷裂。 結(jié)果：枸杞多糖、原花青素、硒、鋅各處理組的Olive尾距與同劑量單獨染氟組比較差異有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)，且均低于對照組。染氟劑量為0.25，0.50，2.00，4mmol/L，400mg/L枸杞多糖處理組比100mg/L、200mg/L枸杞多糖處理組的Olive尾距小(P0.05)；染氟劑量為0.00，0.25，0.50，1.00mmol/L，10mg/L原花青素組比25mg/L、50mg/L原花青素處理組的Olive尾距小(P0.05)，但是隨著染氟劑量的升高，25mg/L、50mg/L原花青素組比10mg原花青素處理組的Olive尾距小(P0.05)；染氟劑量為0.00，0.25，0.50，1.00，2.00，4.00mmol/L，2.5μmol/L硒處理組比5μmol/L、10μmol/L硒處理組的Olive尾距小(P0.05)；染氟劑量為0.00，0.25，0.50，1.00，2.00，4.00mmol/L，10μmol/L鋅處理組比5μmol/L，20μmol/L鋅處理組的Olive尾距小(P0.05)。 結(jié)論：枸杞多糖、原花青素、硒、鋅在一定劑量范圍內(nèi)可有效拮抗過量氟導(dǎo)致的DNA的損傷作用，對氟中毒小鼠成釉細胞有明顯的保護作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣東藥學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R114

【參考文獻】

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本文編號：2444893