【摘要】：背景 電離輻射誘導機體發(fā)生急、慢性炎性反應,進而破壞機體免疫平衡,并表現(xiàn)為淋巴細胞中各細胞亞群的比例失衡,Treg細胞作為淋巴細胞的重要免疫調(diào)節(jié)亞群,在輻射照射后細胞數(shù)目、比例及表型的改變將直接影響機體免疫平衡,為此近年來已有學者對Treg細胞輻射敏感性方面開展了初步研究,但隨著對Treg細胞研究的進一步深入,明確了許多與Treg細胞表型和功能相關的轉(zhuǎn)錄因子與表面分子,而這些分子的差異表達往往與炎性反應類型和所在的器官不同而不同,其中哪些因子在輻射誘導的炎性反應中發(fā)揮作用尚未見相關研究報道。 目的 分析不同劑量丫射線照射對淋巴細胞及其Treg亞群細胞數(shù)和細胞比例的影響,并在此基礎上明確2Gyγ射線照射對Treg細胞凋亡率、增殖能力及Treg細胞表型的影響,進而分析Treg細胞凋亡與表型改變之間的關系和靶向作用于差別表達表型因子的microRNA的表達變化,探討表型改變及其潛在作用的基因水平調(diào)控機制,為輻射誘導免疫失衡的預防與恢復治療提供理論依據(jù)。 方法 1.利用不同劑量(0.25Gy,0.5Gy,0.75Gy,1Gy,2Gy和5Gy)60Coy射線全身照射小鼠,分離胸腺和脾臟中的淋巴細胞并進行計數(shù),再利用FACS檢測Treg細胞亞群的比例變化； 2.2Gy γ射線照射離體小鼠胸腺淋巴細胞,在照后9h利用FACS檢測Treg細胞及Tcon細胞中7-AAD的結合水平； 3.2Gy γ射線全身照射小鼠,在照后1、4和10d分離胸腺和脾臟淋巴細胞,利用FACS檢測Treg細胞及Tcon細胞Annexin-V和Ki-67的表達,檢測Treg細胞核心轉(zhuǎn)錄因子FOXP3的表達,檢測Treg細胞表型因子CD39、CD103等的表達,檢測nTreg細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Helios的表達,檢測凋亡相關因子Bcl-2、 Bax的表達； 4.檢索靶向作用于CD39的microRNAs,并利用real-time PCR對檢索到的microRNAs進行擴增分析,擴增底物為從分選的CD4+T細胞中提取的RNA； 5.分選CD4+CD25+Treg細胞,利用ATP檢測試劑盒檢測Treg細胞內(nèi)ATP水平。 結果 1.小鼠受照后胸腺細胞和脾臟細胞呈劑量依賴性減少,在照后4d降至最低(F=118.08、144.01,p0.05)。較高劑量(1-5Gy)照射后,胸腺中Treg細胞數(shù)隨時間逐漸減少,而脾臟中該細胞亞群逐漸恢復；而較低劑量照射后胸腺中Treg細胞數(shù)有所增加。與0Gy組相比較,Treg細胞比例隨劑量增加而增加(F胸腺=5.16、89.44、3.01,p0.05；F脾臟=52.02、32.13、27.45,p0.05)； 2.離體Treg細胞自然存活率低于Tcon細胞,2Gy γ射線照射后,二者存活率均減小,后者減小幅度顯著(t=-14.03,p0.05)； 3.全身受照后4d, Treg細胞凋亡率顯著增加,且高于Tcon細胞；不同器官中Treg細胞凋亡率和增殖水平改變不同,一方面胸腺Treg細胞凋亡率低于脾臟,另一方面胸腺中Ki-67+Treg細胞比例在受照后1d先減小,至照后4d又增加,而脾臟中該比例先增加,至照后4d相對對照組有所恢復； 4.受照后FOXP3+Treg細胞占CD4+T細胞的比例增加,單個細胞中FOXP3的MFI變化在胸腺中下調(diào),在脾臟中上調(diào),但均在受照后10d改變最為顯著(t=3.22,-5.34；p0.05)；而Helios的表達相對穩(wěn)定,胸腺與脾臟中的變化規(guī)律基本一致； 5.受照后Treg細胞中CD39和CD103的表達具有顯著差異,其中CD39+Treg細胞比例增加,單個Treg細胞中CD39的MFI在胸腺中上調(diào)而在脾臟中下調(diào)；CD103+Treg細胞比例變化在脾臟中先下調(diào)后上調(diào),在胸腺中于受照后4d出現(xiàn)一過性上調(diào),單個Treg細胞CD103的MFI在胸腺中下調(diào),而在脾臟中上調(diào)； 6.胸腺Treg細胞中Bcl-2的MFI變化無統(tǒng)計學意義,而Bax的MFI呈上調(diào)趨勢,Bax/Bcl-2比值亦上調(diào)(t=-3.43,p0.05)；脾臟中的變化規(guī)律相反,Bcl-2的MFI持續(xù)上調(diào),而Bax的MFI變化無統(tǒng)計學意義,Bax/Bcl-2比值下調(diào)t=2.40,p0.05)；單個Treg細胞中CD39的MFI變化規(guī)律與Bax/Bcl-2比值變化規(guī)律一致； 7.利用microRNA數(shù)據(jù)庫檢索了靶向作用于CD39的microRNAs,檢索結果有6個,然后利用real-time PCR進行擴增分析發(fā)現(xiàn)miR-31的表達變化與CD39的MFI變化規(guī)律基本一致。 結論 1.不同劑量照射對淋巴細胞及其Treg細胞亞群細胞數(shù)的影響不同,其中較高劑量誘導Treg細胞數(shù)減少,而低劑量照射誘導其增加；淋巴細胞與Treg細胞亞群之間具有不同的時間響應； 2.離體Treg細胞對輻射具有抗性,但輻射可誘導全身照射的Treg細胞凋亡率顯著增加,且輻射誘導Treg細胞凋亡率與增殖能力的改變隨受照后時間和所處器官的不同而具有不同規(guī)律,表明Treg細胞的活性受所處微環(huán)境的影響顯著。 3.Bax和Bcl-2分別在胸腺和脾臟的輻射誘導Treg細胞凋亡過程中發(fā)揮主要作用,Bax/Bcl-2比值的改變可以反映Treg細胞的凋亡水平,且Bax和Bcl-2參與的Treg細胞凋亡機制中受CD39的正向調(diào)節(jié)； 4.輻射可誘導FOXP3的表達改變,Treg細胞具有可塑性；同時輻射可誘導Treg細胞表型改變,其中CD39和CD103是輻射誘導Treg細胞表達差異的兩個重要表面因子, CD103介導輻射誘導炎性反應中Treg細胞的遷移,而CD39的表達差異則主要參與Treg細胞的抗輻射誘導凋亡； 5.CD39的表達水平變化受外在微環(huán)境的影響,也有基因水平的調(diào)節(jié),其中miR-31對其發(fā)揮負向靶向調(diào)節(jié)作用。
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【學位授予單位】：中國疾病預防控制中心
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R114

【參考文獻】

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1 孟凡旭;單玉興;董娟聰;金順子;;不同劑量電離輻射對小鼠脾臟調(diào)節(jié)性T細胞及TGF-β1表達的影響[J];吉林大學學報(醫(yī)學版);2011年03期

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本文編號：2413383