發(fā)布時間：2018-11-23 16:22

【摘要】：目的:隨著越來越多的化學(xué)物進入人類的生產(chǎn)和生活,如何對化學(xué)物潛在的毒性進行安全性評價,成為當(dāng)今全球廣泛關(guān)注的問題。一般傳統(tǒng)的動物實驗,存在實驗周期較長,影響因素復(fù)雜等諸多方面問題;而體外實驗缺乏各種生理屏障,不具備體內(nèi)代謝作用等缺點,影響了結(jié)果外推到人。本實驗擬通過建立體外細胞模型替代方法,克服目前體外實驗的缺點,對外源化合物的毒性進行更為快速準(zhǔn)確的評價。方法:1體外血腦屏障(blood brain barrier,BBB)模型的建立和驗證:免疫印跡法測定人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)細胞的緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1、Occludin-1和Claudins的表達。用HUVEC和膠質(zhì)瘤細胞(C6),通過非接觸式共培養(yǎng),建立體外BBB模型。用Millicell-ERS儀測定共培養(yǎng)模型的跨內(nèi)皮阻抗(Trans-endotheilal electrical resistance,TEER)驗證BBB的緊密連接性,用辣根過氧化物酶(HRP)的示蹤效應(yīng)驗證BBB的通透性。2多器官細胞共培養(yǎng)(integrate discrete multiple organ cell co-culture,idMOC)模型的建立和驗證:采用自制的多器官細胞共培養(yǎng)板。在十二孔板中,每四個孔為一組,在距離孔板底部一定高度處進行打孔,各孔間可互相連通。培養(yǎng)時,將HK-2細胞、L-02細胞和SH-SY5Y細胞接種于自制的多器官細胞共培養(yǎng)板的不同孔中,并使其互相連通,觀察HK-2細胞、人L-02肝細胞和SH-SY5Y細胞生長情況,建立共培養(yǎng)模型。每天取三塊共培養(yǎng)的細胞培養(yǎng)板和三塊單培養(yǎng)的細胞培養(yǎng)板,進行檢測直至第四天。CCK-8法分別測量共培養(yǎng)和單獨培養(yǎng)下的生長曲線,觀察共培養(yǎng)條件下各組織細胞與單獨培養(yǎng)條件下生長曲線是否一致,確定idMOC模型是否建立成功。3 BBB和idMOC模型的應(yīng)用:以140μg/ml、270μg/ml濃度的丙烯酰胺(Acrylamide,ACR)對SH-SY5Y直接染毒;ACR經(jīng)BBB后,取孔板內(nèi)全部培養(yǎng)基對SH-SY5Y染毒;以及ACR在idMOC條件下對SH-SY5Y染毒,流式細胞分析不同處理條件下SH-SY5Y細胞晚期凋亡率的變化,探索BBB和idMOC體外模型的應(yīng)用。結(jié)果:1體外BBB模型的建立1.1體外BBB模型的建立BBB形成的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)在于內(nèi)皮細胞間形成緊密連接(tight junction,Tj),本實驗對所用細胞株HUVEC的Tj相關(guān)蛋白Occludin、claudins和ZO-1免疫印跡結(jié)果顯示呈高表達,可以用來構(gòu)建體外BBB模型。本實驗通過共培養(yǎng)的方法成功建立了HUVEC單細胞模型和HUVEC細胞與C6細胞的共培養(yǎng)模型。1.2體外BBB模型的驗證HUVEC在C6膠質(zhì)細胞的作用下,細胞間可以形成廣泛的緊密連接復(fù)合體進而抑制外加電場下電流的跨內(nèi)皮運動,產(chǎn)生了高達235Ω/cm2的TEER值;并且TEER值均數(shù)在4、5、6 d時均高于內(nèi)皮細胞單獨培養(yǎng)組,差異有顯著性意義(P0.05)。一般而言TEER值越大,說明BBB的通透性愈小,其屏障功能愈好。HRP與底物反應(yīng)后產(chǎn)生顯色反應(yīng),在450 nm的吸光度(D450)與HRP濃度具有良好的線性關(guān)系,說明在60 min的測試過程中各模型的性能穩(wěn)定。在20 min后各時間點HRP的累計清除量(△TCl)共培養(yǎng)組均小于單獨培養(yǎng)組,差異有顯著性意義(P0.05),表明共培養(yǎng)組的屏障功能高于單獨培養(yǎng)組。2體外idMOC模型的建立:2.1 idMOC模型的建立利用自制的多器官細胞共培養(yǎng)板,建立了穩(wěn)定的idMOC模型。各種細胞間可通過培養(yǎng)板的交換孔進行物質(zhì)交換,細胞生長狀態(tài)良好,無明顯死亡。通過該共培養(yǎng)模型,模擬了物質(zhì)在體內(nèi)經(jīng)肝臟和其他代謝器官的代謝過程。2.2 idMOC模型的驗證通過共培養(yǎng)組與單獨培養(yǎng)相比,共培養(yǎng)組細胞與單獨陪養(yǎng)組相比生長曲線基本一致,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3 BBB和idMOC模型的應(yīng)用:利用ACR對SH-SY5Y細胞直接染毒、和經(jīng)過BBB和idMOC模型后染毒,觀察晚期凋亡率。140μg/m L、270μg/m L ACR直接染毒組,晚期凋亡率分別為(23.53±1.80、82.57±2.56);ACR經(jīng)BBB后染毒組,晚期凋亡率分別為(20.27±0.57、73.83±0.76);經(jīng)idMOC模型染毒組,晚期凋亡率從分別為(12.73±1.00、52.73±1.56%)。不同濃度ACR經(jīng)過BBB和idMOC模型后染毒,對SH-SY5Y細胞的毒性作用顯著降低。結(jié)論:1成功建立了基于HUVEC細胞和C6細胞共培養(yǎng)體系的體外BBB模型。2成功建立了以HK-2細胞、人L-02肝細胞和SH-SY5Y細胞共培養(yǎng)為基礎(chǔ)的體外idMOC代謝模型。3不同濃度ACR經(jīng)過BBB和idMOC模型后染毒,對SH-SY5Y細胞的毒性作用顯著降低,說明體外BBB的屏障效應(yīng)和體外idMOC模型的代謝可以減弱ACR毒性的作用。
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【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R114

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 梁靜;劉軍;賀全國;;血腦屏障通透性增效方法的研究進展[J];化學(xué)通報;2015年03期

2 陳雪;王軍;王偉;駱翔;喻志源;;體外血腦屏障模型的建立及功能測定[J];卒中與神經(jīng)疾病;2014年04期

3 張水華;季龍鳳;馬t，

本文編號：2352050