【摘要】：全氟辛烷磺酸(Perfluorooetane sulfonate,PFOS)是廣泛存在的,化學(xué)性質(zhì)非常穩(wěn)定的環(huán)境污染物。PFOS被發(fā)現(xiàn)存在潛在的神經(jīng)毒性,尤其對(duì)于處在生長(zhǎng)發(fā)育期的動(dòng)物更為敏感。海馬是大腦參與學(xué)習(xí)、記憶過程中的重要結(jié)構(gòu),海馬齒狀回的神經(jīng)干細(xì)胞是成年后能增殖、分化成神經(jīng)元的部位之一,其極易受外界環(huán)境因素的影響,導(dǎo)致神經(jīng)發(fā)生不足。近年來,對(duì)于PFOS引起的神經(jīng)毒性作用受到關(guān)注,但其損傷機(jī)制尚不清楚,更無有效的手段來修復(fù)其對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。外源性神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)移植作為一種治療手段,能代替、修復(fù)中樞損傷的神經(jīng)元,為腦損傷修復(fù)帶來了希望。研究目的:探討PFOS暴露對(duì)新生鼠海馬結(jié)構(gòu)和認(rèn)知功能影響及可能的損害機(jī)制,同時(shí)探討外源性NSCs移植可能的干預(yù)作用。研究方法:實(shí)驗(yàn)一:將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為對(duì)照組和模型組,每組各35只。模型組給予PFOS 10mg/kg·d腹腔注射染毒,對(duì)照組給予等量含2%Tween-80的生理鹽水,共4周。記錄體重,并行水迷宮、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、滾輪實(shí)驗(yàn)以觀察神經(jīng)行為變化,確定造模成功。取海馬組織行HE染色,觀察形態(tài)結(jié)構(gòu)改變。實(shí)驗(yàn)二:取新生一天SD幼鼠第三腦室室管膜區(qū)組織完成神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定,經(jīng)枕大池行蛛網(wǎng)膜下腔神經(jīng)干細(xì)胞移植,將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為:對(duì)照組(Con)、單純移植組(T)、移植干預(yù)組(P10+T)和模型組(P10),分別在移植后1、2、4周記錄體重,同時(shí)行水迷宮、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)等觀察神經(jīng)行為變化,并在移植后第4周,取材采用HE染色觀察NSCs移植對(duì)海馬組織形態(tài)的影響;采用Western blot和qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)海馬?7nAChR蛋白和mRNA的表達(dá)水平;采用ELISA法觀察血清IL-1?;采用高效液相法測(cè)定海馬組織氨基酸水平。實(shí)驗(yàn)三:將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為對(duì)照組(Con,等量生理鹽水),低劑量染毒組(p5,5mg/kg·dpfos組),高劑量染毒組(p10,10mg/kg·dpfos組),每組10只,染毒4周。4周后,采用dot-blot技術(shù),檢測(cè)炎性因子cinc-3、cntf、il-1?、il-6、tnf-?的變化;采用western-blot和qrt-pcr檢測(cè)海馬組織表觀遺傳修飾相關(guān)調(diào)控酶dmnt3a、epc1、suv420h2、hdac8蛋白和mrna表達(dá)水平。結(jié)果:實(shí)驗(yàn)一:1.pfos暴露對(duì)一般情況的影響,模型組出現(xiàn)肛門周圍糞便沾染嚴(yán)重,活動(dòng)減緩、少動(dòng)呆臥、嗜睡、進(jìn)食量減少及消瘦等神經(jīng)抑制癥狀,同時(shí),模型組與對(duì)照組比較,幼鼠體重增長(zhǎng)減緩(p0.05);2.pfos暴露對(duì)神經(jīng)行為的影響,結(jié)果顯示:水迷宮實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)的第2天,模型組的逃逸潛伏期即長(zhǎng)于對(duì)照組(p0.05),并隨暴露時(shí)間顯著性差異更加明顯(p0.01),在第5天撤去平臺(tái)測(cè)試時(shí),模型組目標(biāo)象限停留時(shí)間和跨臺(tái)次數(shù)均少于對(duì)照組(p0.05、p0.01);曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中,與對(duì)照組比較,模型組的中央格停留時(shí)間長(zhǎng)(p0.01)、站立次數(shù)少(p0.01)、總距離短(p0.01);滾輪實(shí)驗(yàn)中,模型組在轉(zhuǎn)桿上持續(xù)的時(shí)間與對(duì)照組比較無顯著性差異(p0.05);3.pfos暴露對(duì)海馬組織形態(tài)的影響,模型組海馬神經(jīng)元排列紊亂、輪廓模糊、核固縮,并且海馬ca1區(qū)和齒狀回閂區(qū)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量也明顯少于對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)二:1.外源性nscs移植對(duì)一般情況的影響,結(jié)果顯示:與p10組比較,p10+t組在移植后4周時(shí)精神逐漸好轉(zhuǎn)、活動(dòng)增加,但體重仍無顯著性差異(p㧐0.05);2.外源性nscs移植對(duì)神經(jīng)行為學(xué)的影響,結(jié)果顯示:移植后4周,與p10組比較,p10+t組目標(biāo)象限停留時(shí)間延長(zhǎng)(p㩳0.05)、中央格停留時(shí)間明顯縮短(p㩳0.01)、站立次數(shù)增多(p㩳0.05),行走總距離增長(zhǎng)(p㩳0.05);3.外源性nscs移植對(duì)海馬組織形態(tài)的影響,結(jié)果顯示:p10+t組與p10組比較,神經(jīng)元排列趨于整齊、密度增高、細(xì)胞形態(tài)有所恢復(fù);4.外源nscs移植對(duì)大鼠海馬炎性因子il-1?的影響,與con組比較,p10組血清中il-1?明顯升高(p㩳0.001);p10+t組的il-1?水平與p10組比較顯著下降(p㩳0.001);5.外源性nscs移植對(duì)海馬?7nachr的影響,結(jié)果顯示:與con組比較,p10組?7nachr蛋白和mrna表達(dá)水平明顯降低(均為p0.001);與p10組比較,p10+t組海馬區(qū)?7nachr蛋白和mrna表達(dá)水平均明顯升高(均為p0.001);6.外源性nscs移植對(duì)海馬組織氨基酸水平的影響,結(jié)果顯示:與con組比較,p10組谷氨酸含量明顯降低(p㩳0.05);而與p10組比較,p10+t組谷氨酸含量明顯升高(P㩳0.05)。實(shí)驗(yàn)三:1.PFOS早期暴露對(duì)海馬組織炎性因子的影響,與Con組比較,P5組和P10組的CINC-3、CNTF、IL-1b、IL-6、TNF-a等炎性因子水平均明顯升高。與P5組比較,P10組海馬CINC-3、CNTF、TNF-a的表達(dá)水平均明顯升高(P0.05);2.PFOS早期暴露對(duì)海馬組織表觀遺傳修飾相關(guān)調(diào)控酶的影響,Western blot檢測(cè)Dmnt3a、EpC1、Suv420h2、Hdac8蛋白表達(dá)水平,結(jié)果顯示,與Con組比較,P5和P10組Dmnt3a均明顯增高(P0.01),而EpC1、Suv420h2、Hdac8蛋白表達(dá)水平,P5組明顯降低(P0.05、P0.001、P0.001),P10組也明顯降低(P0.01、P0.001、P0.001)。同時(shí),與P5組比較,P10組Dmnt3a明顯增高(P0.05),而EpC1、Suv420h2、Hdac8蛋白表達(dá)水平明顯降低(P0.01)。采用qRT-PCR進(jìn)一步觀察Dmnt3a、EpC1、Suv420h2、Hdac8 mRNA水平的變化,與Con組比較,P5組Dmnt3a mRNA表達(dá)水平無明顯差異(P㧐0.05),而EpC1、Suv420h2、Hdac8 mRNA表達(dá)水平明顯降低(P0.01、P0.001、P0.001)。同時(shí),P10組Dmnt3a mRNA表達(dá)水平顯著增高(P0.001),而EpC1、Suv420h2、Hdac8 mRNA表達(dá)水平均降低(均為P0.001)。但P10組與P5組比較,以上mRNA表達(dá)均無明顯差異(P㧐0.05)。結(jié)論:1.PFOS早期暴露可損害海馬組織結(jié)構(gòu)和引起空間學(xué)習(xí)記功能障礙;2.PFOS暴露的神經(jīng)毒性機(jī)制可能與海馬區(qū)出現(xiàn)表觀遺傳修飾異常和免疫炎性反應(yīng)有關(guān);3.外源性NSCs移植可以促進(jìn)海馬膽堿能神經(jīng)元表達(dá)、抑制神經(jīng)免疫炎性反應(yīng),進(jìn)而抑制PFOS對(duì)海馬的神經(jīng)毒性作用,改善記憶功能。
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【學(xué)位授予單位】：寧夏醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R114

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2317054