【摘要】：目的苯并[α]芘(Benzo(a)pyrene,B(a)P)是已知的致畸、致癌、致突變及內(nèi)分泌干擾物,大量的研究顯示,B(a)P可以引起子癇、子宮內(nèi)生長(zhǎng)受限、流產(chǎn)等滋養(yǎng)層相關(guān)疾病,然而潛在機(jī)制尚不明確。本研究擬通過(guò)B(a)P在體內(nèi)的代謝終致突變物7,8-二羥基-9,10-環(huán)氧苯并[α]芘(BPDE)對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞系Swan 71進(jìn)行染毒,觀察其細(xì)胞和線粒體功能的改變及其具體分子機(jī)制。探索線粒體損傷在滋養(yǎng)層細(xì)胞功能紊亂中的作用,為滋養(yǎng)層相關(guān)疾病的治療提供新的思路。方法1.MTT法檢測(cè)BPDE對(duì)Swan 71細(xì)胞活力的影響,根據(jù)結(jié)果確立染毒濃度和時(shí)間。采用Transwell的方法檢測(cè)各組細(xì)胞的侵襲能力;采用ELISA和Western blot的方法測(cè)定各組細(xì)胞HCG分泌能力;流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡;酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA和SOD的含量;RT-qPCR檢測(cè)促炎因子(TNF-а、IL-6)mRNA的改變;熒光顯微鏡觀察線粒體膜電位的改變;透射電鏡觀察線粒體形態(tài)和結(jié)構(gòu)的改變;實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)線粒體DNA拷貝數(shù)的改變。2.采用RT-qPCR、Western blot技術(shù)檢測(cè)線粒體各組分裂融合基因和蛋白(Mfn1、Mfn2、OPA1、Drp1和Fis1)的表達(dá)情況。采用Western blot的方法對(duì)凋亡相關(guān)蛋白(P53、Bcl-2、Bak和Bax)、線粒體和胞漿中的Cyt c以及Caspase3前體和活化產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果1.BPDE對(duì)Swan 71細(xì)胞功能的影響與對(duì)照組相比,0.1μmol/L、0.2μmol/L、0.4μmol/L和0.8μmol/L組Swan 71細(xì)胞的侵襲能力逐漸減弱,且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001);與對(duì)照組相比,0.5μmol/L、1μmol/L和2μmol/L組Swan 71細(xì)胞上清中HCG的含量和細(xì)胞絨毛膜促性腺激素β蛋白的表達(dá)量逐漸降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);BPDE可以促進(jìn)Swan 71細(xì)胞凋亡,且0.5μmol/L、1μmol/L和2μmol/L組與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)2.BPDE對(duì)Swan 71細(xì)胞氧化損傷的影響與對(duì)照組相比,0.25μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L和2μmol/L組細(xì)胞內(nèi)ROS和MDA的水平逐漸增加,SOD的水平逐漸下降,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與對(duì)照組相比,1μmol/L和2μmol/L組促炎因子TNF-а和IL-6 mRNA表達(dá)逐步上調(diào),且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。3.BPDE對(duì)Swan 71細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)和功能的影響隨著B(niǎo)PDE濃度的增加,線粒體膜電位逐漸降低;透射電鏡觀察,0.5μmol/L組線粒體線粒體腫脹扭曲,線粒體嵴紊亂,膜片段化,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹。1μmol/L組線粒體顯示出更嚴(yán)重的空泡化、破裂和溶解,線粒體嵴溶解,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)呈泡狀結(jié)構(gòu)。線粒體DNA拷貝數(shù)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),0.25μmol/L、0.5μmol/L和1μmol/L組與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4.BPDE對(duì)Swan 71細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響隨著B(niǎo)PDE濃度的增加,P53、Bak1和Bax的蛋白表達(dá)量逐漸增加,Bcl-2的蛋白表達(dá)量逐漸降低。且除P53 0.25μmol/L組外各染毒組與對(duì)照組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5.BPDE對(duì)Swan 71細(xì)胞分裂融合基因的影響與對(duì)照組相比,0.5μmol/L、1μmol/L和2μmol/L組線粒體融合基因OPA1、Mfn1和Mfn2表達(dá)逐漸下降,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);0.5μmol/L、1μmol/L和2μmol/L組線粒體分裂基因Fis1表達(dá)逐漸上調(diào),1μmol/L和2μmol/L組Drp1表達(dá)逐漸上調(diào),差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與對(duì)照組相比,0.5μmol/L、1μmol/L和2μmol/L組線粒體融合蛋白OPA1表達(dá)逐漸下降,各染毒組中Mfn1和Mfn2表達(dá)逐漸下降,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);各染毒組中Drp1和Fis1表達(dá)逐漸上調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。6.BPDE對(duì)Swan 71細(xì)胞Cyt c釋放和Caspase 3的影響隨著B(niǎo)PDE濃度的增加,胞漿中的Cyt c蛋白的含量逐漸增加,而線粒體中的Cyt c蛋白的含量逐漸下降,Caspase 3前體逐漸減少,而活化的Caspase 3逐漸增多,且除0.25μmol/L組外差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論BPDE可誘導(dǎo)Swan 71細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷引起線粒體分裂增加而融合下降,造成線粒體膜片段化釋放Cyt c,引發(fā)線粒體途徑的凋亡,導(dǎo)致Swan 71細(xì)胞侵襲和HCG分泌功能障礙,為BPDE引起的滋養(yǎng)層相關(guān)疾病治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
[Abstract]:Benzo (a) ptyrene, B (a) P) is a known carcinogens, carcinogenic, mutagenic and endocrine disruptors, and a large number of studies show that B (a) P can induce trophoblast-related diseases such as eclampsia, intrauterine growth restriction, abortion, etc. However, the underlying mechanism is not yet clear. In this study, the change of cell and mitochondrial function and its specific molecular mechanism were observed by B (a) P metabolism in the body. The changes of cell and mitochondrial function and their specific molecular mechanism were observed in the trophoblast cell line Swan 71. To explore the role of mitochondrial damage in the functional disturbance of trophoblast cells and to provide a new idea for the treatment of trophoblast-related diseases. Methods 1. MTT assay was used to detect the effect of BPDE on the viability of Swan 71 cells, and the concentration and time of exposure were established according to the results. The invasion ability of all groups of cells was detected by Transwell's method, and the secretion ability of the cells was determined by ELISA and Western blot. The cell apoptosis was detected by flow cytometry. The contents of ROS, MDA and SOD in cells were detected by ELISA. The changes of the expression of TNF-CoV and IL-6 mRNA were detected by RT-qPCR. The changes of mitochondrial DNA number were observed by fluorescence microscope; the changes of mitochondrial morphology and structure were observed by transmission electron microscope; the change of mitochondrial DNA copy number was detected by real-time fluorescence quantitative PCR. RT-qPCR and Western blot were used to detect the expression of fusion genes and proteins (Mfn1, Mfn2, OPA1, Drp1, and CD1). Apoptosis-related proteins (P53, Bcl-2, Bk and Bax), Cyt c in mitochondria and cytoplasm, and Caspase3 precursor and activation products were detected by Western blot. Results 1. The effect of BPDE on the function of Swan 71 cells was 0. 1. mol/ L, 0.2. mol/ L, 0.4. mol/ L and 0.9. mol/ L, and the invasive ability of Swan 71 cells was decreased gradually, and the difference was statistically significant (P0.05). In 1. mol/ L and 2. m mol/ L group of Swan 71 cells, there was a statistically significant difference (P0.05). The BPDE could promote the apoptosis of Swan 71 cells and 0.5mumol/ L. Compared with the control group, the effect of BPDE on the oxidative damage of Swan 71 cells was 0. 25 ug/ L, 0.5. mol/ L, 1. m mol/ L and 2. m mol/ L, the levels of ROS and MDA increased gradually, and the level of SOD decreased gradually. The difference was statistically significant (P0.05). Compared with the control group, the expression of TNF-and IL-6 mRNA was up-regulated in 1. m u.mol/ L and 2. m mol/ L group, and the difference was statistically significant (P0.001). The effect of BPDE on the mitochondrial structure and function of Swan 71 cell decreased with the increase of BPDE concentration. Mitochondrial DNA was gradually decreased; transmission electron microscope observation, 0. 5 ug/ L group of mitochondrial swelling distortion, mitochondrial membrane disturbance, membrane fragmentation, reticulum swelling. 1. mu mol/ L group of mitochondria showed more serious vacuolization, rupture and dissolution, mitochondria were dissolved, and the Endoplasmic reticulum was in a bubble structure. Compared with the control group, the effect of BPDE on the apoptosis-related protein of Swan 71 cells increased with the increase of BPDE concentration, and the expression of P53, Bak1 and Bax increased gradually. The expression of Bcl-2 protein decreased gradually. Compared with the control group, the expression of OPA1, Mfn1 and Mfn2 in the mitochondrial fusion gene OPA1, Mfn1 and Mfn2 decreased gradually. The differences were statistically significant (P 0.05); 0. 5. m u.mol/ L, 1. m mol/ L and 2. m u.mol/ L, the expression of DS1 was gradually increased, and the expression of Drp1 in 1. m u.mol/ L and 2. m u.mol/ L groups was gradually increased, and the difference was statistically significant (P0.05). Compared with the control group, the expression of OPA1 in 0.5. mol/ L, 1. m mol/ L and 2. m mol/ L group decreased gradually, and the expression of Mfn1 and Mfn2 in each group was gradually decreased, and the difference was statistically significant (P0.05). The difference was statistically significant (P0.001). The effect of BPDE on the release of Cyt c and Caspase 3 in Swan 71 cells increased with the increase of BPDE concentration, the content of Cyt c protein in cytoplasm gradually increased, and the content of Cyt c protein in mitochondria gradually decreased, Caspase 3 precursor decreased gradually, and the activated Caspase 3 increased gradually. All the differences were statistically significant except for 0. 25 ug/ L group (P0.05). Conclusion BPDE can induce the increase of mitochondrial fragmentation caused by oxidative damage of Swan 71 cells, which causes mitochondrial membrane fragmentation to release Cyt c and induce apoptosis of mitochondrial pathway, which leads to the invasion of Swan 71 cells and the dysfunction of urinary tract secretion. provides experimental basis for the treatment of trophoblast related diseases caused by BPDE.
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R114

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本文編號(hào)：2307387