【摘要】：亨廷頓�。℉untington’s disease,HD）是一種常染色體顯性遺傳的神經系統(tǒng)退行性疾病，影響肌肉的協(xié)調并導致認知功能減退和癡呆。HD由HD基因突變導致。HD基因可編碼亨廷頓蛋白（huntingtin，Htt）。在正常人群中，HD基因中CAG的重復數(shù)為10-35個。當HD基因發(fā)生突變，CAG重復數(shù)超過35時便出現(xiàn)HD。突變HD基因的第一外顯子中的CAG重復序列異常增加（超過35次），其編碼的Htt氨基末端中的谷氨酰胺重復序列異常擴展。這種突變可導致紋狀體(尾狀核和殼核)內中等大小有棘神經元細胞死亡，尤其是投射性GABA神經元和III、V、VI層大腦運動皮層的錐體細胞發(fā)生退行性變和死亡，這些與紋狀體的萎縮有關。目前減緩HD進展的方法有：減少的突變Htt的產生；提高細胞的生存能力，更換丟失的神經元等。正常Htt在神經元胞質內呈彌散分布，而在HD患者和HD轉基因動物模型的腦內，突變Htt在細胞內錯誤折疊而形成不可溶的聚集物定位在神經元核內和突起(包括軸突和軸突終末)內，分別稱為核內聚集物(intranuclear aggregates)和神經氈聚集物(neuropil aggregates)。這種聚集物在HD的發(fā)病過程中扮演著重要角色。 盡管HD的發(fā)病基因已被找到，但發(fā)病的機制目前還不清楚，至今也無有效治療HD的方法。真核細胞主要通過泛素-蛋白酶體與自體吞噬系統(tǒng)降解蛋白質，增強突變Htt的清除對于防止亨廷頓病病理發(fā)生至關重要，這一過程主要由泛素-蛋白酶體與自體吞噬途徑介導。大量體外和體內實驗證據(jù)表明，，在HD中，突變Htt可誘發(fā)氧化應激，后者可進一步損壞UPS功能而導致突變Htt聚集。因此，抗氧化藥物已經成為治療HD的一大焦點。 黃酮類化合物是有超過6000個不同的化合物的植物次生代謝產物的一個大集團。對黃酮類化合物的大量觀測，在體內和體外實驗都表明其生理和生物學效應廣泛。生物學功能如抗過敏，抗炎，抗病毒，抗癌和抗增殖活性，這些早已被確認。幾種黃酮類化合物已被證明對各種誘變劑或致癌物質的具有抗突變作用。黃酮類化合物還能發(fā)揮多重保護作用，包括潛在的神經元損傷保護作用；抑制發(fā)炎反應；和潛在的促進學習，記憶與認知的功能等。 異鼠李素（Isorhamnetin），也稱3,5,7-三羥基-2-(4-羥基-3-甲氧基苯基)苯并吡喃-4-酮，是一種黃酮類化合物，它是希臘和丹麥的一種食品，也存在于中國沙棘果汁中。該藥具有抗脂質過氧化，擴冠，抑制血小板聚集，降低大鼠血清和肝臟的膽固醇濃度等功能。 本研究利用HD細胞模型觀察了異鼠李素對突變Htt細胞毒性的影響并探索其機制。結果表明，異鼠李素能抑制突變Htt細胞毒性，其機制除了其具有的抗氧化作用之外，更重要的是促進了突變Htt的蛋白酶體性和自噬性途徑降解。 1.異鼠李素抑制突變Htt對N2a細胞的毒性 為探討異鼠李素對突變Htt毒性的影響，我們分別用1.0μg的cherry-20Q(表達正常htt)或cherry-160Q(突變Htt)質粒瞬時轉染N2a細胞，6h后用不同濃度的異鼠李素處理轉染的細胞，轉染48h后應用臺盼藍（Trypan Blue)染色檢測細胞活性。結果表明，異鼠李素處理可明顯降低160Q細胞中臺盼藍染色陽性細胞的百分率，說明異鼠李素處理能呈劑量依賴性抑制160Q細胞的活性下降。進一步的內源性激活型caspase3水平的免疫印跡檢測顯示，異鼠李素處理能呈劑量依賴抑制突變Htt對caspase3的激活。由此表明，異鼠李素對突變Htt的細胞毒性具有明顯的抑制作用。 2.異鼠李素能降低表達突變Htt的N2a細胞內聚集型和可容型Htt 為了明確異鼠李素對突變Htt聚集物形成的影響，對表達突變Htt的細胞內聚集物的含量在經異鼠李素處理后的變化進行了檢測。在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，在經異鼠李素處理后表達160Q的N2a細胞中突變Htt聚集物的數(shù)量明顯減少。異鼠李素呈劑量依賴性抑制160Q細胞聚集物的形成。通過Western Blot技術，我們發(fā)現(xiàn)突變Htt聚集物在表達160Q的細胞內呈時間依賴性增加，異鼠李素處理后，可溶型與聚集型突變亨廷頓蛋白顯著降。因此，異鼠李素導致的突變Htt含量減少可能通過促進突變Htt的降解和/或抑制突變Htt聚集所致。 3.異鼠李素減少突變Htt聚集物與Nrf2通路的激活相關 為了了解異鼠李素是否通過激活Nrf2通路的來減少突變Htt聚集物，對調節(jié)抗氧化反應元件（antioxidant responsive element, ARE）轉錄因子核因子E2相關因子2（nuclear factor erythroid-2related factor2, Nrf2）在異鼠李素減少突變聚集物的作用進行了檢測。免疫印跡分析顯示，異鼠李素處理后的160Q細胞內Nrf2表達水平較未處理的160Q細胞明顯升高。同時我們還發(fā)現(xiàn)，與未經處理的對照組相比，異鼠李素也增加HO-1蛋白的水平（這是一種細胞保護酶，在炎癥過程中防御氧化損傷起關鍵作用）。這些結果表明，異鼠李素可以激活Nrf2-ARE途徑，這被認為是對氧化應激的保護機制；從而降低突變HTT的聚集和毒性作用。因此，異鼠李素減少突變Htt聚集物與Nrf2通路的激活相關。 4.異鼠李素促進突變Htt的蛋白酶體途徑和自噬途徑降解 為了明確蛋白酶體途徑是否參與了異鼠李素對突變Htt的降解，首先我們檢測了蛋白酶體抑制劑MG132能否阻斷異鼠李素對突變Htt的降解作用。免疫印跡結果顯示，在異鼠李素處理的160Q中加入MG132可阻斷異鼠李素減少聚集型突變Htt的作用，但不能阻斷可溶型突變Htt的降低。 異鼠李素還可以減少可溶型突變Htt，但MG132不能阻斷這一現(xiàn)象，因此，推測其他降解途徑可能也參與了異鼠李素促進可溶型突變Htt降解的過程。首先我們考慮是否自噬降解途徑參與了這一過程，為此，我們在異鼠李素處理的160Q細胞中加入自噬抑制劑3-Methyladenine(3—MA)。結果顯示，3—MA可阻斷異鼠李素減少可溶型突變Htt的作用。以上結果顯示，異鼠李素通過促進蛋白酶體途徑和誘導激活自噬途徑降解繼而促進聚集型和可溶型突變Htt的降解。 結論：異鼠李素可以通過多種途徑降解突變Htt:促進蛋白酶體系統(tǒng)降解聚集型突變Htt;誘導激活自噬系統(tǒng)，降解可容型突變Htt;通過促進轉錄因子核因子E2相關因子2（Nrf2）的表達，進而有效抑制突變Htt的氧化應激作用，促進細胞生存。異鼠李素正是通過以上途徑使突變Htt減少是其抑制突變Htt細胞毒性的主要機制。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R114

【共引文獻】

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本文編號：2274511