【摘要】：目的：赭曲霉毒素A（OchratoxinA, OTA）是由曲霉菌屬和青霉菌屬的某些菌株產(chǎn)生的一種真菌毒素，其污染非常普遍，在糧食作物和食品中存在非常廣泛。OTA的主要毒性作用器官是腎臟，OTA可能是巴爾干地方性腎病的主要致病原，1993年國際癌癥研究中心IARC將OTA列為“可能的人類致癌物”。除外腎毒性，動物實驗研究還發(fā)現(xiàn)OTA具有免疫毒性、肝毒性、神經(jīng)毒性、致突變性、致畸性和致癌性等生物效應。長期食用OTA污染的飼料，可以誘發(fā)F344/N大鼠出現(xiàn)前胃上皮細胞增生和乳腺纖維腺瘤。由于在食物中分布的廣泛性，人類很容易長期暴露于OTA的毒性環(huán)境中。 研究表明一些真菌毒素的早期毒性作用是通過引起凋亡、增殖抑制或者周期阻滯，比如脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮及煙曲霉毒素B1。我們實驗室前期研究工作發(fā)現(xiàn)，OTA通過下調(diào)人胃黏膜上皮細胞周期調(diào)控關(guān)鍵蛋白（Cdc25C、Cdc2和CyclinB1）的表達引起細胞G2期阻滯，提示OTA可通過G2期阻滯來發(fā)揮其部分毒性作用，在中國倉鼠肺成纖維細胞（V79）及非洲綠猴腎臟細胞（CV-1）中，OTA也通過導致G2期阻滯來發(fā)揮其毒性作用。 絲裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）級聯(lián)是細胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)之一，參與細胞的各種生理及病理活動，包括細胞增殖、分化和凋亡。MAPKs家族最主要的成員為ERK（細胞外信號調(diào)節(jié)激酶）通路，JNK/SAPK（c-Jun氨基末端激酶/應激活化蛋白激酶）通路和p38MAPK通路。研究表明在各種刺激因素的作用下，細胞可以通過激活或抑制MAPK信號通路而啟動細胞G2期檢測點，使細胞發(fā)生G2期阻滯。Yang等人發(fā)現(xiàn)脫氧雪腐鐮刀菌烯醇介導的G2/M阻滯是通過ERK1/2信號通路增強p_21水平實現(xiàn)的。然而，目前有關(guān)OTA誘導人胃黏膜上皮細胞G2阻滯的相關(guān)分子機制尚不明了。 鑒于MAPK信號通路在細胞周期中的重要作用，我們提出這樣的假設(shè)，即MAPK信號通路可能參與OTA誘導的人胃黏膜上皮細胞G2期阻滯。為驗證本假設(shè)，本實驗將觀察JNK、ERK和p38MAPK信號通路在OTA誘導的G2期阻滯中的作用，以期揭示OTA誘導體外人胃黏膜上皮細胞G2期阻滯的可能分子機制。 方法： 1細胞培養(yǎng)與處理 正常人胃黏膜上皮細胞（GES-1）培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2培養(yǎng)，細胞貼壁生長。 選擇對數(shù)生長期的細胞（傳代后24h）隨機分為溶劑對照組和實驗組。實驗組給予OTA，使其終濃度分別為5、10、20μM，溶劑對照組給予終濃度為0.08%的甲醇（每組設(shè)平行樣本3個），繼續(xù)培養(yǎng)24h收集細胞進行相關(guān)指標檢測。 2阻斷劑處理 對數(shù)生長期GES-1細胞，分別給予10μM SB203580（p38的阻斷劑或者10μM PD98059（ERK的阻斷劑）預處理30min。實驗分為4組，即溶劑對照組、阻斷劑組、OTA處理組和阻斷劑+OTA處理組。細胞處理24h后收集細胞檢測相關(guān)指標。 3siRNA轉(zhuǎn)染 分別用100pmol ERK和p38特異性siRNA轉(zhuǎn)染細胞，再加入20μMOTA繼續(xù)培養(yǎng)24h收集細胞進行相關(guān)指標檢測。同時轉(zhuǎn)染Negtive controlsiRNA（NC siRNA）作為陰性對照。檢測ERK和p38基因被干擾后對OTA誘導的G2期阻滯的影響。 4流式細胞術(shù)檢測細胞周期（FCM）OTA作用24h后，分別收集各組細胞，PBS洗滌，離心收集細胞，用70%冰乙醇固定檢測細胞周期分布情況。 5蛋白免疫印跡（Western blot） OTA處理GES-1細胞24h后，提取細胞總蛋白，用蛋白免疫印跡方法，檢測OTA處理后人胃黏膜上皮細胞GES-1中JNK/磷酸化型JNK、ERK/磷酸化型ERK和p_38/磷酸化型p38以及G2期調(diào)控蛋白的表達情況。 6免疫共沉淀（IP） 提取細胞總蛋白，120μg各組蛋白加入1μg CyclinB1抗體4℃搖床過夜，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測Cdc2-CyclinB1復合物的形成情況 7統(tǒng)計 采用SPSS13.0軟件進行相關(guān)分析與單因素方差分析（analysis ofvariance, ANOVA），數(shù)據(jù)用x±s表示，檢驗以P0.05為差異有顯著性意義。 結(jié)果： 1OTA對體外培養(yǎng)GES-1細胞JNK、ERK和p38信號通路的影響 1.1OTA使GES-1細胞內(nèi)的ERK和p38磷酸化水平升高，對JNK無影響 Western blot結(jié)果顯示，OTA5、10和20μM處理24h后，p38和ERK磷酸化水平明顯高于溶劑對照組（P0.05），而JNK磷酸化蛋白相對表達量與溶劑對照組比較差異無顯著性（P0.05）。同時，各OTA處理組細胞內(nèi)非磷酸化p_38、ERK和JNK蛋白水平均未發(fā)生明顯變化（P0.05）。 1.2ERK和p38阻斷劑可對抗OTA引起的ERK和p38磷酸化水平的升高 結(jié)果顯示，與OTA20μM處理組相比，ERK的磷酸化水平在PD98059+OTA組明顯降低（P0.05）。同樣的，SB203580預處理也逆轉(zhuǎn)了OTA引起的p38磷酸化水平的升高（P0.05）。 以上結(jié)果表明，OTA處理可以激活GES-1細胞內(nèi)的p38和ERK信號通路，而對JNK通路并未造成影響。 2阻斷ERK信號通路對OTA誘導的GES-1細胞G2期阻滯的影響 2.1ERK特異性阻斷劑（PD98059）預處理對OTA誘導的GES-1細胞G2期阻滯的影響 FCM結(jié)果顯示，PD98059預處理+OTA20μM組G0/G1期細胞比例較20μM OTA單獨處理組明顯增加，G2/M期細胞比例則顯著降低（P0.05）。表明PD98059可以部分逆轉(zhuǎn)OTA誘導的GES-1細胞G2阻滯。 2.2ERK siRNA干擾對OTA誘導的GES-1細胞G2期阻滯的影響 FCM研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NC siRNA處理組與溶劑對照組細胞周期分布無明顯差異（P0.05）。ERK siRNA轉(zhuǎn)染則可以顯著逆轉(zhuǎn)OTA對GES-1細胞周期的影響，即顯著了升高G0/G1期細胞比例，降低了G2/M期細胞的比例（P0.05）。表明ERK siRNA轉(zhuǎn)染可部分逆轉(zhuǎn)OTA誘導的GES-1細胞G2期阻滯。 上述結(jié)果表明ERK信號通路參與OTA誘導的GES-1細胞G2期阻滯。 3阻斷p38信號通路對OTA誘導的GES-1細胞G2期阻滯的影響 3.1p38特異性阻斷劑（SB203580）預處理對OTA誘導的GES-1細胞G2期阻滯的影響 FCM結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SB203580預處理對細胞周期的影響類似于PD98059，即與OTA20μM處理組相比，SB203580預處理降低了GES-1細胞的G2/M期細胞比例（P0.05）。表明SB203580可以部分逆轉(zhuǎn)OTA誘導的GES-1細胞G2阻滯。 3.2p38siRNA干擾對OTA誘導的GES-1細胞G2期阻滯的影響 FCM研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NC siRNA處理組細胞周期分布與溶劑對照組相比無明顯差異（P0.05）。而p38siRNA轉(zhuǎn)染則顯著逆轉(zhuǎn)了OTA導致的G2期阻滯（P0.05）。 以上結(jié)果證明p38信號通路參與OTA誘導的GES-1細胞G2期阻滯。 4阻斷ERK信號通路對OTA誘導的GES-1細胞G2期調(diào)控蛋白的影響 4.1ERK特異性阻斷劑（PD98059）預處理對GES-1細胞G2期調(diào)控蛋白的影響 Western blot結(jié)果顯示，與20μM OTA處理組相比，PD98059預處理+OTA20μM組G2期相關(guān)蛋白（Cdc25C、Cdc2和CyclinB1）及磷酸化形式的Cdc25C和Cdc2的表達明顯增加（P0.05）。 IP結(jié)果顯示，PD98059預處理GES-1細胞同時增加了Cdc2-CyclinB1復合物的形成（P0.05）。 表明PD98059預處理可逆轉(zhuǎn)OTA對GES-1細胞G2期調(diào)控蛋白表達降低的影響。 4.2ERK siRNA干擾對GES-1細胞G2期調(diào)控蛋白的影響 Western blot檢測結(jié)果顯示，ERK siRNA轉(zhuǎn)染可對抗OTA引起的Cdc2/磷酸化型Cdc2、Cdc25C/磷酸化型Cdc25C和CyclinB1蛋白表達的下降（P0.05）。NC siRNA處理組細胞內(nèi)上述蛋白的相對表達量與溶劑對照組比較差異無顯著性（P0.05）。 IP結(jié)果顯示，NC siRNA處理組細胞內(nèi)Cdc2-CyclinB1復合物與溶劑對照組相比沒有明顯差別（P0.05），而與OTA20μM處理組相比，，ERKsiRNA+OTA20μM處理組Cdc2-CyclinB1復合物明顯增多（P0.05）。 以上結(jié)果提示，ERK信號通路通過調(diào)控G2期調(diào)控蛋白（Cdc25C、Cdc2和CyclinB1）的表達參與OTA誘導的p38-1細胞G2期阻滯。 5阻斷p38信號通路對p38-1細胞G2期調(diào)控蛋白的影響 5.1p38特異性阻斷劑（SB203580）預處理對p38-1細胞G2期調(diào)控蛋白的影響 Western blot結(jié)果顯示，SB203580預處理+OTA20μM組與20μMOTA處理組相比，Cdc2/磷酸化型Cdc2、Cdc25C/磷酸化型Cdc25C和CyclinB1蛋白的表達明顯增加（P0.05）。 另外，IP結(jié)果顯示，與OTA20μM處理組相比，SB203580預處理+OTA20μM處理組Cdc2-CyclinB1復合物明顯增多（P0.05）。 5.2p38siRNA干擾對p38-1細胞G2期調(diào)控蛋白的影響 Western blot檢測結(jié)果顯示，NC siRNA處理組細胞內(nèi)Cdc2/磷酸化型Cdc2、Cdc25C/磷酸化型Cdc25C和CyclinB1蛋白相對表達量與溶劑對照組比較差異無顯著性（P0.05）。而p38siRNA轉(zhuǎn)染后可以對抗OTA引起的上述蛋白的下降（P0.05）。 IP結(jié)果顯示，Cdc2-CyclinB1復合物在NC siRNA處理組與溶劑對照組相比沒有明顯差別（P0.05），而p38siRNA轉(zhuǎn)染顯著逆轉(zhuǎn)了OTA20μM引起的Cdc2-CyclinB1復合物的降低（P0.05）。 以上結(jié)果提示，p38MAPK信號通路通過調(diào)控G2期調(diào)控蛋白（Cdc25C、Cdc2和CyclinB1）的表達參與OTA誘導的p38-1細胞G2期阻滯。 結(jié)論： 1赭曲霉毒素A作用于p38-1細胞24h，可以激活ERK和p38MAPK信號轉(zhuǎn)導通路，對JNK信號通路并未造成影響。 2阻斷ERK和p38MAPK信號通路可對抗赭曲霉毒素A對p38-1細胞的G2期阻滯作用。 3阻斷ERK和p38MAPK信號通路可對抗赭曲霉毒素A對G2期調(diào)控關(guān)鍵蛋白（Cdc2/p-Cdc2、Cdc25C/p-Cdc25C、CyclinB1）和Cdc2-CyclinB1復合物的降低作用。 4ERK和p_38MAPK信號通路通過調(diào)控G2期調(diào)控蛋白（Cdc25C、Cdc和CyclinB1）的表達參與OTA誘導的GES-1細胞G2期阻滯。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R114

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本文編號：2258351