【摘要】：新型環(huán)境持久性有機污染物全氟辛烷磺酸（Perfluorooctane sulfonate，PFOS），性質(zhì)穩(wěn)定蓄積性強，由PFOS污染帶來的健康危害已越來越引起人們關(guān)注。PFOS不但可誘導肝臟、神經(jīng)、免疫及內(nèi)分泌系統(tǒng)的損害，而且對動物的生殖發(fā)育也有影響。近年來在PFOS生殖毒性研究中，主要關(guān)注了PFOS對雄性的內(nèi)分泌干擾作用，以及經(jīng)此途徑誘導雄性生殖損傷相關(guān)分子機制。然而，對于PFOS是否能夠通過血—睪屏障進入睪丸及是否能夠發(fā)揮直接破壞作用尚未見報道。血—睪屏障是廣泛存在于哺乳動物睪丸中的一種特殊的“血—組織”屏障結(jié)構(gòu)，對維持正常的精子發(fā)生具有重要意義。近年來，血—睪屏障在外源性化學物誘導的雄性生殖損害過程中的作用越來越引起關(guān)注。PFOS若存在睪丸的直接損傷，，需通過血—睪屏障進入睪丸實質(zhì)，闡明PFOS影響血—睪屏障及其分子機制有助于全面認識PFOS誘導的雄性生殖損傷過程。 本研究緊緊圍繞上述問題，建立整體及體外PFOS染毒模型，評估血—睪屏障結(jié)構(gòu)和功能的變化，分析血—睪屏障相關(guān)連接蛋白表達及定位改變，尋找睪丸內(nèi)PFOS毒作用關(guān)鍵的靶細胞和靶分子，明確關(guān)鍵信號通路在PFOS調(diào)控血—睪屏障中的作用，從而深入探討PFOS對血—睪屏障結(jié)構(gòu)和功能影響的分子機制。為化學物的生殖毒理學研究提供提供有益的補充和技術(shù)支撐，也為環(huán)境持久性有機污染物的生殖風險評估、危害控制及預防提供重要參考。 第一部分：PFOS致雄性小鼠生殖毒效應的研究 目的：建立PFOS雄性生殖損傷模型，明確PFOS對睪丸的直接損傷作用，尋找關(guān)鍵的靶細胞。方法：一定劑量的PFOS給予ICR小鼠經(jīng)口灌胃染毒，通過體重及臟器系數(shù)觀察一般毒性；運用放免法檢測血清生殖相關(guān)激素觀察PFOS內(nèi)分泌干擾效應；運用光鏡及電鏡在形態(tài)上觀察睪丸生精上皮的破壞，尋找關(guān)鍵的靶細胞。采用計算機輔助精子分析系統(tǒng)（Computer-assisted sperm analysis，CASA）觀察精子相關(guān)參數(shù)，確認PFOS對精子發(fā)生的影響。結(jié)果：1.一般毒性：在0~50mg/kg/d劑量下，PFOS未對動物生長發(fā)育產(chǎn)生顯著影響，睪丸和附睪的臟器系數(shù)也未出現(xiàn)顯著改變。2.血清生殖激素：與對照組相比，PFOS可顯著誘導動物血清睪酮（Testosterone，T）水平降低，而其它如雌激素（Estradiol，E2）、促卵泡生成素（Follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）、促黃體生成素（Luteinizinghormone，LH）變化則不顯著。3.睪丸形態(tài)學：光鏡下，PFOS可顯著誘導睪丸支持細胞空泡化，在高劑量組生精小管腔可見自生精上皮剝脫的未成熟生精細胞。電鏡下，與對照組相比，2.5、25和50mg/kg/d劑量組睪丸出現(xiàn)顯著的支持細胞空泡化改變，細胞內(nèi)出現(xiàn)較多脂滴。4.精子參數(shù)：PFOS可顯著降低動物精子計數(shù)，并呈劑量依賴關(guān)系，尤其在2.5、25和50mg/kg/d劑量組（0.25和2.5mg/kg/d劑量組，p0.05；25和50mg/kg/d劑量組，p0.01）。50mg/kg/d劑量的PFOS可顯著降低精子活動率（p0.05），25和50mg/kg/d劑量的PFOS可顯著降低快速細胞百分率（25mg/kg/d劑量組，p0.05；50mg/kg/d劑量組，p0.01）。 第二部分：PFOS對小鼠血—睪屏障結(jié)構(gòu)及功能的影響 目的：探討PFOS對血—睪屏障結(jié)構(gòu)和功能的影響，在整體水平分析相關(guān)的分子機制。方法：利用已建立的PFOS染毒小鼠模型，采用電鏡觀察PFOS對血—睪屏障結(jié)構(gòu)的破壞；利用生物素示蹤劑觀察PFOS對血—睪屏障功能的影響；運用UPLC/MS/MS檢測血清及睪丸中的PFOS暴露，分析PFOS通過血—睪屏障的能力；采用免疫印跡和免疫組化檢測睪丸組織血—睪屏障相關(guān)連接蛋白的表達和定位，探討關(guān)鍵的靶分子和相關(guān)分子機制。結(jié)果：1.血—睪屏障超微結(jié)構(gòu)：與對照組相比，2.5到50mg/kg/d劑量組血—睪屏障超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯的肌動蛋白束缺失，緊密連接解體和囊泡。2.血—睪屏障功能：與對照組相比，2.5到50mg/kg/d劑量組的睪丸組織可見生物素示蹤劑跨過血—睪屏障進入生精小管的頂端室。3. PFOS通過血—睪屏障的能力：與對照組相比，在各PFOS處理組的血清和睪丸樣品中均可檢測出PFOS。血清PFOS水平與睪丸PFOS含量呈正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)=0.9676，Pearson，p0.0001）4.血—睪屏障連接相關(guān)蛋白的表達和定位：PFOS可下調(diào)睪丸緊密連接相關(guān)蛋白（Tight junction，TJ）：ZO-1(2.5，25和50mg/kg/d劑量組，p0.01)、 Claudin-11和Occludin (2.5mg/kg/d劑量組， p0.05；25和50mg/kg/d劑量組，p0.01)的表達。同樣縫隙連接相關(guān)蛋白（Gap junction，GJ）：Connexin-43(25和50mg/kg/d劑量組，p0.05)和p-Connexin-43(2.5，25和50mg/kg/d劑量組，p0.05)表達也下調(diào)，并呈劑量依賴關(guān)系。此外，2.5到50mg/kg/d劑量的PFOS還可顯著降低ZO-1、Claudin-11、Occludin和Connexin-43血—睪屏障處的定位。5.絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路的激活：磷酸化的Erk和p-38表達顯著增加(p-Erk，25和50mg/kg/d劑量組，p0.01；p-p38，2.5mg/kg/d劑量組，p0.05，25和50mg/kg/d劑量組，p0.01)。 第三部分：PFOS靶向Sertoli細胞影響血—睪屏障功能的機制研究 目的：探討支持細胞在PFOS誘導的血—睪屏障破壞過程中的作用，分析血—睪屏障連接相關(guān)蛋白表達和定位改變與MAPK信號通路激活的關(guān)系。方法：采用細胞毒性實驗篩選對PFOS敏感細胞株，驗證整體水平的結(jié)果；運用RT-PCR的方法鑒定支持細胞株上PFOS相關(guān)轉(zhuǎn)運體的表達，驗證PFOS靶向支持細胞作用可能的途徑。采用免疫印跡和免疫熒光分析血—睪屏障相關(guān)連接蛋白的表達和定位，驗證整體水平的結(jié)果，并探討相關(guān)的分子機制。運用MAPK信號通路特異性抑制劑聯(lián)合PFOS共同處理支持細胞，采用免疫印跡法及免疫熒光分析關(guān)鍵連接蛋白表達的變化，確認MAPK信號通路與支持細胞上血—睪屏障連接相關(guān)蛋白表達和定位改變的關(guān)系。采用原代支持細胞對部分重要結(jié)果進行驗證。結(jié)果：1.細胞毒性實驗結(jié)果：相對其它睪丸細胞株，支持細胞株（TM4）對PFOS毒作用相對敏感。2. PFOS相關(guān)轉(zhuǎn)運體的鑒定：支持細胞株上表達有OAT1、OATP1和OATP3。3.支持細胞血—睪屏障相關(guān)連接蛋白的表達及定位：PFOS可顯著誘導連接蛋白Claudin-11、ZO-1、Occludin、Connexin-43和p-Connexin-43表達下調(diào)（p0.05或p0.01）。Claudin-11和Connexin-43的細胞定位：隨著劑量增加，細胞漿Claudin-11表達顯著下降，尤其在高劑量組（100和150μM）。Connexin-43主要表達在細胞膜上，隨著PFOS劑量增加，表達也呈下降趨勢。4. MAPK特異性抑制劑與PFOS聯(lián)合處理后血—睪屏障相關(guān)蛋白的表達和定位：JNK和Erk MAPK信號通路特異性抑制劑不能逆轉(zhuǎn)PFOS誘導的連接蛋白下調(diào)。與之相反，p-38MAPK信號通路特異性抑制劑可顯著抑制PFOS誘導的連接蛋白表達下調(diào)及細胞膜定位減少。5.原代支持細胞驗證：PFOS可誘導原代支持細胞屏障功能下降及TJ蛋白（ZO-1、Claudin-11和Occludin）和GJ蛋白（Connexin-43和p-Connexin-43）表達的下調(diào)（20和30μM，p0.05或p0.01）；p-38MAPK信號通路特異性抑制劑SB203580可顯著抑制PFOS誘導原代支持細胞屏障功能的下降及連接蛋白表達的下調(diào)。 結(jié)論 1. PFOS可誘導雄性ICR小鼠生殖損傷，支持細胞很可能是PFOS的重要作用靶點。 2. PFOS可破壞血—睪屏障結(jié)構(gòu)和功能，使得PFOS能進入生精上皮，從而發(fā)揮直接的生殖毒作用。血—睪屏障連接相關(guān)蛋白ZO-1、Claudin-11、Occludin、Connexin-43和p-Connexin-43很可能是PFOS毒作用的靶分子，與PFOS誘導的血—睪屏障結(jié)構(gòu)和功能破壞有關(guān)。 3. PFOS可能通過靶向支持細胞，激活p38MAPK信號通路，下調(diào)血—睪屏障連接相關(guān)蛋白的表達及細胞定位，從而誘導血—睪屏障結(jié)構(gòu)和功能的破壞。該機制在PFOS誘導的雄性生殖損傷中可能起關(guān)鍵作用。
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【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R114

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