本文選題：左卡尼汀 + HL7702細胞　； 參考：《青島大學》2016年博士論文

【摘要】：目的:左卡尼汀(L-carnitine,LC)又稱左旋肉堿,是人體必需的一種類維生素營養(yǎng)素,在動物性食品中含量豐富。臨床研究發(fā)現,肝病病人體內LC缺乏,外源性補充LC對多種肝病具有輔助治療作用。實驗研究也證實,LC對多種因素誘導的肝損傷具有保護作用。目前,LC保肝作用分子機制尚未闡明,本課題將建立過氧化氫(hydrogen peroxide,H_2O_2)誘導的人HL7702肝細胞損傷模型,從抗氧化、細胞信號轉導分子(Nrf_2、MAPK、PI3K/Akt、PPAR-α、AMPK、GSK-3β)的角度探究LC保護肝細胞損傷的分子機制。方法:1.LC對H_2O_2損傷HL7702肝細胞活性及抗氧化能力的影響:實驗設計為:正常對照組、H_2O_2損傷組、LC組(0.1、0.5、1.0 mmol/L)。分別以MTT、乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase,LDH)法檢測細胞活性;酶化學法測定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)活性及丙二醛(MDA)含量;以2,7-二氯氫化熒光素二酯(DCFH-DA)為熒光探針,流式細胞術測定細胞內活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平。2.LC對核因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf_2)/血紅素加氧酶1(heme oxygenase,HO-1)通路的調控:Western blot技術檢測Nrf_2、HO-1蛋白的經時表達;免疫熒光染色法確定Nrf_2的核轉位;凝膠遷移實驗(Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA)評價Nrf_2-DNA結合活性;Nrf_2 si RNA技術分析Nrf_2與HO-1的級聯(lián)關系及Nrf_2在LC保護肝細胞損傷中的作用。3.LC對絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B,PI3K/Akt)通路的調控:Western blot測定H_2O_2損傷HL7702細胞MAPK、PI3K/Akt通路的變化及LC的影響;應用相應抑制劑,分析JNK、ERK、p38MAPK在H_2O_2損傷HL7702細胞中的作用;采用Akt抑制劑IV評價Akt是否參與了LC的保護作用以及LC對Nrf_2/HO-1通路的激活作用。4.LC對H_2O_2損傷HL7702細胞脂肪酸代謝、能量代謝相關基因表達的影響:Western blot技術檢測過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferator-activated receptors-α,PPAR-α)的經時表達,并從m RNA和蛋白水平測定LC對PPAR-α及其下游基因肉毒堿棕櫚酸轉移酶1(CPT1)、脂肪酰基輔酶A氧化酶(ACOX)的影響;分析PPAR-α在LC保護細胞損傷中的作用及與SOD、CAT的相關性;測定H_2O_2損傷HL7702細胞腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)、糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)的經時變化特點及LC的調節(jié)作用;應用相應抑制劑分析AMPK在LC保護細胞損傷中的作用以及PI3K/Akt、AMPK與GSK-3β的級聯(lián)關系。結果:1.以0.3 mmol/L H_2O_2損傷HL7702細胞12 h為病理模型。0.1?1.0 mmol/L LC劑量依賴性抑制了H_2O_2引起的細胞活性降低及LDH釋放(P0.05,P0.01)。與正常對照組相比,H_2O_2損傷組細胞SOD和CAT蛋白表達水平顯著下降(P0.01),SOD和CAT活性分別下降了30.07%和38.26%,ROS及MDA水平顯著增加,分別為對照組的3.8倍和1.7倍;LC能夠抑制H_2O_2引起的SOD、CAT蛋白表達及活性的降低,以及ROS、MDA水平的增加(P0.05,P0.01)。2.經時表達分析發(fā)現,H_2O_2損傷1 h細胞核Nrf_2表達迅速升高,隨后逐漸降低,HO-1表達呈逐漸上升趨勢;LC預孵育對H_2O_2誘導的Nrf_2核轉位、Nrf_2-DNA結合活性升高及HO-1蛋白表達增加均有明顯促進作用(P0.05);Nrf_2 si RNA技術將細胞Nrf_2沉默后,抑制了LC的保護作用及增強HO-1表達的作用。3.H_2O_2損傷后p-JNK、p-ERK、p-p38MAPK表達均迅速升高,p-Akt表達呈先升高后降低的雙相改變;LC能有效抑制H_2O_2引起的p-JNK、p-p38MAPK表達升高(P0.05,P0.01),但對p-ERK表達無明顯影響;LC既能增強損傷1 h時p-Akt的升高(P0.01),又能抑制損傷12 h時p-Akt的降低(P0.01)。除ERK抑制劑外,JNK、p38MAPK、Akt抑制劑均能有效抑制H_2O_2引起細胞活性降低(P0.05),且Akt抑制劑也抑制了LC對Nrf_2/HO-1通路的激活作用。4.本研究首次發(fā)現,H_2O_2損傷肝細胞時PPAR-α蛋白表達逐漸降低;LC預孵育能增強PPAR-α及其下游基因CPT1、ACOX的表達(P0.05,P0.01);PPAR-α激動劑能有效抑制H_2O_2引起的SOD、CAT活性及細胞活性的降低;PPAR-α抑制劑阻斷了LC增強SOD、CAT表達及細胞活性的作用。p-AMPK、p-GSK-3β表達在H_2O_2損傷后逐漸降低,LC對其均有明顯抑制作用(P0.01),且能抑制AMPK上游激酶肝激酶B1(Liver kinase B1,LKB1)及下游底物乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-Co A carboxylase,ACC)的活性降低(P0.05,P0.01)。AMPK抑制劑阻斷了LC增強細胞活性及p-GSK-3β表達的作用,Akt抑制劑對LC增強p-GSK-3β表達的作用無影響。結論:1.LC保護H_2O_2損傷HL7702細胞的作用與升高SOD、CAT活性,降低ROS及MDA水平有關。2.LC通過激活Akt/Nrf_2/HO-1通路保護H_2O_2誘導的HL7702細胞損傷。3.JNK、p38MAPK的激活參與H_2O_2損傷HL7702細胞,LC的保護作用與抑制JNK、p38MAPK的激活有關;ERK未參與H_2O_2的損傷作用,且與LC的保護作用無關。4.PPAR-α參與了H_2O_2誘導的HL7702細胞損傷。LC通過增加PPAR-α及其下游基因CPT1、ACOX表達,激活LKB1/AMPK/ACC通路,抑制GSK-3β活性而保護H_2O_2誘導的HL7702細胞損傷,且PPAR-α表達增加與SOD、CAT的表達增加有關。
[Abstract]:Objective : L - carnitine ( LC ) , also known as L - carnitine , is a kind of vitamin nutrient necessary for human body and is rich in animal food . )娉曟嫻嬬粏鑳?yōu)娲绘�，

本文編號：1884658