本文選題：線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運(yùn)體 + Pb~(2+)��； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：背景 目前鉛中毒仍是公共衛(wèi)生學(xué)方面的難題之一,環(huán)境中鉛暴露對(duì)人體健康產(chǎn)生重大威脅。鉛是一種對(duì)全身組織有廣泛親和力的毒物,不僅對(duì)人體大腦、心臟、腎臟和肝臟有嚴(yán)重毒性,且鉛對(duì)健康危害最強(qiáng)的是神經(jīng)毒性,導(dǎo)致神經(jīng)功能紊亂,表現(xiàn)為鉛毒性腦病、周圍神經(jīng)病變、聽(tīng)力障礙和認(rèn)知缺陷等。鉛作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的毒物,對(duì)神經(jīng)功能產(chǎn)生不可逆的毒性作用,尤其對(duì)正在發(fā)育的兒童神經(jīng)系統(tǒng)。最近很多流行病學(xué)研究指出,妊娠期低濃度鉛暴露可導(dǎo)致兒童認(rèn)知功能損傷和行為功能缺陷。同時(shí)有文獻(xiàn)表明在動(dòng)物和人群中,鉛暴露可誘導(dǎo)發(fā)育中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生損害作用,表現(xiàn)為認(rèn)知功能損傷、生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、多動(dòng)癥和神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)虧損等。因此研究鉛神經(jīng)毒性的意義非常重大。目前鉛神經(jīng)毒性機(jī)制主要包括鉛與鈣離子的競(jìng)爭(zhēng)作用、鉛致細(xì)胞凋亡以及鉛對(duì)神經(jīng)元的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷等。而產(chǎn)生鉛神經(jīng)毒性的具體機(jī)制尚未清楚,但是有很多文獻(xiàn)報(bào)道鉛誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激是鉛神經(jīng)毒性的機(jī)制之一[。研究表明低濃度鉛可通過(guò)損傷細(xì)胞膜、DNA和抗氧化防御系統(tǒng)來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激。由于神經(jīng)系統(tǒng)富含可被氧化的脂質(zhì),因此對(duì)鉛誘導(dǎo)的氧化損傷尤其敏感。鈣離子是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中不可缺少的離子,具有多種重要的細(xì)胞功能。有文獻(xiàn)指出鉛誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性可能與鉛引起的鈣離子紊亂有關(guān),這可能是因?yàn)殂U可擾亂鈣離子的運(yùn)輸過(guò)程。據(jù)此研究鉛神經(jīng)毒性機(jī)制是一個(gè)具有深遠(yuǎn)意義的課題,闡明鉛致神經(jīng)元細(xì)胞氧化應(yīng)激機(jī)制對(duì)于明確鉛神經(jīng)毒性以及調(diào)節(jié)相關(guān)的病理生理過(guò)程都有重要的意義,并為進(jìn)一步明確相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制和發(fā)現(xiàn)新的分子治療靶點(diǎn)提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 線粒體在維持細(xì)胞內(nèi)離子平衡、能量代謝以及對(duì)外界因素的應(yīng)激方面發(fā)揮著重要的作用。而且線粒體是產(chǎn)生活性氧自由基的主要場(chǎng)所,過(guò)多的活性氧自由基(reactiveoxidespecies, ROS)和活性氮自由基(reactive nitrogen species，，RNS)的產(chǎn)生是發(fā)生氧化應(yīng)激的必要條件。有文獻(xiàn)報(bào)道鉛可誘導(dǎo)活性氧自由基的產(chǎn)生對(duì)機(jī)體造成氧化損傷,而且通過(guò)降低質(zhì)膜對(duì)活性氧自由基的防御能力和削弱細(xì)胞的抗氧化系統(tǒng)防御能力而間接導(dǎo)致氧化應(yīng)激,比如消耗細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽(GSH)含量、抑制超氧化物歧化酶的活性和改變質(zhì)膜的完整性等。線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運(yùn)體(mitochonddrialcalcium uniporter, MCU)位于線粒體內(nèi)膜,是介導(dǎo)鈣離子從線粒體外進(jìn)入線粒體基質(zhì)的重要途徑,參與調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)外鈣的動(dòng)態(tài)平衡,與細(xì)胞能量代謝和存活狀態(tài)有密切聯(lián)系。有文獻(xiàn)指出ROS調(diào)節(jié)著整個(gè)鈣信號(hào)網(wǎng)絡(luò),同時(shí)細(xì)胞內(nèi)的鈣穩(wěn)態(tài)也調(diào)節(jié)著ROS的產(chǎn)生。鈣離子作為第二信使,在細(xì)胞的生理病理功能中發(fā)揮著不可替代的作用,而且有報(bào)道稱氟化物誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣離子釋放導(dǎo)致活性氧自由基的活化,從而發(fā)揮其細(xì)胞毒性作用。而鉛離子的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制與鈣離子的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制相似,這有助于鉛離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并易于在細(xì)胞內(nèi)分布,因此鉛可與某些鈣結(jié)合蛋白結(jié)合而產(chǎn)生細(xì)胞毒性。MCU是選擇性鈣離子通道,對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)發(fā)揮著重要作用。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,鉛是鈣離子的競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑,而且鉛可通過(guò)阻礙外鈣濃度增加來(lái)抑制alpha7乙酰膽堿受體的活性而發(fā)揮鉛神經(jīng)毒性作用。因此,盡管目前對(duì)鉛神經(jīng)毒性機(jī)制的研究在各方面都取得了巨大成果,但是線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運(yùn)體是否在鉛誘導(dǎo)的神經(jīng)元氧化應(yīng)激這一過(guò)程起作用尚不清楚,而且鉛是否通過(guò)線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運(yùn)體來(lái)干擾線粒體內(nèi)鈣平衡,從而打破細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)來(lái)發(fā)揮鉛的神經(jīng)毒性作用,目前尚未見(jiàn)報(bào)道。 目的 本研究旨在探討低濃度鉛對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤(SH-SY5Y)細(xì)胞、新生大鼠海馬原代神經(jīng)元和仔鼠海馬氧化應(yīng)激的影響,觀察MCU蛋白表達(dá)和線粒體內(nèi)鈣離子變化,進(jìn)一步研究鉛神經(jīng)毒性的分子機(jī)制。 方法 1.取處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞,分別設(shè)對(duì)照組、(2μM、10μM、50μM醋酸鉛處理組在5%CO2、37℃孵育48h后,顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變和MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力。 2.用不同濃度鉛μM、2μM、10μM、50μM)處理SH-SY5Y細(xì)胞48h 后收獲細(xì)胞并檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS和GSH的含量變化。 3.用ROS熒光探針DCFH-DA孵育細(xì)胞后,在激光共聚焦顯微鏡下記錄不同鉛處理組的ROS熒光強(qiáng)度變化。 4.用不同濃度鉛(0μM、2μM、10μM、50μM)處理SH-SY5Y細(xì)胞48h后收獲細(xì)胞并用western blot實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)MCU和nNOS蛋白表達(dá)變化。 5.用0μM、10μM鉛處理SH-SY5Y細(xì)胞48h,再用MCU的激動(dòng)劑精胺和抑制劑Ru360、MCU過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和干擾片段轉(zhuǎn)染處理后檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激情況。 6.用0μM和10μM鉛處理SH-SY5Y細(xì)胞處理48h再加MCU的激動(dòng)劑(spermine)和抑制劑(Ru360)、MCU過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和干擾片段轉(zhuǎn)染處理后再用線粒體鈣指示劑Rhod-2孵育細(xì)胞后,加入2mM外鈣,在激光共聚焦顯微鏡下實(shí)時(shí)記錄不同鉛處理組的線粒體內(nèi)鈣離子變化。 7.取新生乳鼠海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)5天,用MAP-2抗體檢測(cè)新生乳鼠海馬神經(jīng)元純度,分別設(shè)對(duì)照組、(2μM、10μM、50μM醋酸鉛處理組在5%CO2、37℃孵育24h后,顯微鏡下觀察神經(jīng)元突起生長(zhǎng)情況和MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)神經(jīng)元細(xì)胞活力 8.用不同濃度鉛μM、2μM、10μM、50μM)處理原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元24h后收獲細(xì)胞并檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS和GSH的含量變化。 9.用OμM、10μM鉛處理原代海馬神經(jīng)元24h后收獲細(xì)胞提取神經(jīng)元全蛋白并檢測(cè)MCU蛋白表達(dá)變化。 10.用0μ M、10μ M鉛處理原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元24h,再用MCU的激動(dòng)劑精胺和抑制劑Ru360處理后檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激情況。 11.取新生仔鼠哺乳期染鉛21天后收獲仔鼠海馬組織,提取動(dòng)物組織蛋白做western blot實(shí)驗(yàn),分別檢測(cè)動(dòng)物海馬組織中MCU和nNOS蛋白表達(dá)變化。 12.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果以(mean±SD)表示,多組間比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)方差分析(one-way ANO VA)分析。進(jìn)行多組間的兩兩比較時(shí)先采用Homogeneity-of-variance test檢測(cè)方差齊性,若方差齊性(P0.05)則采用LSD法,若方差不齊(P0.05)則采用Dunnett'T3法。P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 1.不同濃度的Pb2+、(0μ M、2μ M、10μ M、50μ M)處理SH-SY5Y細(xì)胞48h后,在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化,與control組相比,隨著鉛濃度的升高,細(xì)胞數(shù)目逐漸變少,細(xì)胞突起變短,體積變小,胞質(zhì)濃縮。隨著鉛濃度的升高,細(xì)胞活力逐漸減低,在鉛濃度10μM組和50μM組分別下降了25.5%和47.0%,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 2.隨著鉛濃度的升高,ROS含量逐漸增多,在鉛濃度10μM和50μ M組分別增多了6.1%和17.3%,,而GSH含量分別減少了10.4%和35.6%,且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 3. SH-SY5Y細(xì)胞ROS熒光強(qiáng)度發(fā)現(xiàn)隨著鉛濃度升高,ROS熒光強(qiáng)度不斷增強(qiáng)。 4.隨著鉛濃度不斷升高,nNOS蛋白表達(dá)顯著性增多而MCU蛋白表達(dá)則顯著性減少(P0.05)。 5.與control組相比,鉛單獨(dú)處理中的ROS顯著性升高而GSH則顯著性下降,MCU激動(dòng)劑精胺以及MCU過(guò)表達(dá)的鉛處理組較鉛單獨(dú)處理組出現(xiàn)GSH顯著性升高、ROS顯著性降低(P0.05),MCU抑制劑Ru360以及MCU干擾的鉛處理組則出現(xiàn)相反的表現(xiàn)。 6.與control組相比,鉛單獨(dú)處理組在加入2mM外鈣時(shí)線粒體內(nèi)鈣離子顯著性增高,而MCU激動(dòng)劑精胺以及MCU過(guò)表達(dá)的鉛處理組較鉛單獨(dú)處理組出現(xiàn)線粒體內(nèi)鈣離子顯著性升高(P0.05), MCU抑制劑Ru360以及MCU干擾的鉛處理組則出現(xiàn)相反的表現(xiàn)。 7.原代海馬神經(jīng)元純度達(dá)90%以上,培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元可做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元經(jīng)10μM鉛處理24h后神經(jīng)元突起數(shù)目較對(duì)照組減少,MTT法檢測(cè)神經(jīng)元細(xì)胞活力發(fā)現(xiàn)隨著鉛濃度的升高,神經(jīng)元細(xì)胞活力不斷下降。 8.與control組相比,ROS含量隨著鉛濃度升高而顯著性增多,GSH含量則出現(xiàn)顯著性降低(P0.05)。 9.原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元經(jīng)10μM鉛處理24h后MCU蛋白表達(dá)減少,且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05) 10.與control組相比,原代海馬神經(jīng)元的鉛單獨(dú)處理ROS顯著性升高而GSH則顯著性下降,而MCU激動(dòng)劑精胺的鉛處理組較鉛單獨(dú)處理組出現(xiàn)GSH顯著性升高、ROS顯著性降低(P0.05), MCU抑制劑Ru360的鉛處理組則出現(xiàn)相反的表現(xiàn),與在SH-SY5Y細(xì)胞中的結(jié)果一致。 11.在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,哺乳期染鉛組與對(duì)照組相比,仔鼠海馬神經(jīng)元的MCU蛋白表達(dá)出現(xiàn)顯著性降低,而nNOS蛋白表達(dá)顯著性升高(P0.05) 結(jié)論 本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,鉛可誘導(dǎo)人SH-SY5Y細(xì)胞、新生大鼠海馬原代神經(jīng)元和哺乳期染鉛仔鼠海馬發(fā)生氧化應(yīng)激,MCU參與了這一鉛誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的過(guò)程,線粒體內(nèi)鈣離子變化在其中起重要作用。
[Abstract]:Background

Lead is a toxic substance with wide affinity to human body tissues . It is suggested that lead exposure can induce oxidative stress in children by damaging cell membrane , DNA and antioxidant defense system .

It is reported that lead is a competitive antagonist of calcium ions , and it can inhibit the activity of superoxide dismutase ( ROS ) and change the integrity of the membrane .

Purpose

The purpose of this study was to investigate the effects of low concentration of lead on oxidative stress in primary and neonatal rat hippocampal neurons and neonatal rat hippocampal neurons , observe the expression of MCU protein and the changes of calcium ion in mitochondria , and further study the molecular mechanism of lead neurotoxicity .

method

1 . After incubation for 48 hours at 5 % CO2 and 37 鈩

本文編號(hào)：1842132