本文選題：硫化碳 + 胚胎毒性��； 參考：《山東大學》2013年碩士論文

【摘要】：研究背景 二硫化碳(Carbon disulfide, CS2)是一種工業(yè)上常用的有機溶劑和重要的化工生產原料,主要用于粘膠纖維(又稱人造絲)的生產。在生產過程中,CS2常因易揮發(fā)而擴散到工作環(huán)境中,對暴露在其中的工人造成多器官損害,而且CS2的從業(yè)人員中以女工為主。 本課題組前期研究結果發(fā)現(xiàn),胚胎植入期暴露于不同劑量的CS2均可導致小鼠胚胎植入數(shù)目的明顯減少,同時均能導致子宮內膜細胞的DNA損傷,并呈現(xiàn)出明顯的劑量反應關系。在生物體內存在DNA的損傷修復功能,它對生物的生存和遺傳穩(wěn)定性的維持至關重要。目前,胚胎植入期CS2暴露后孕鼠子宮內膜細胞DNA損傷的時間變化規(guī)律尚不明確。因此本研究擬通過檢測胚胎植入期CS2暴露后小鼠子宮內膜細胞DNA損傷的變化情況,探討CS2暴露對子宮內膜細胞DNA損傷的時效性影響,為在基因水平上揭示胚胎植入期CS2暴露致胚胎毒性的機制提供理論依據(jù),同時為探討胚胎植入期CS2暴露對孕鼠子宮內膜細胞白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor, LIF)基因完整性的影響提供前提條件。 前期實驗結果還發(fā)現(xiàn),胚胎植入期CS2暴露導致的胚胎植入數(shù)目減少與子宮內內膜相關粘附分了(特別是作為胚胎植入標志性分了LIF)的蛋白和mRNA表達水平的降低有關,但CS2暴露致LIF蛋白及mRNA表達水平降低的機制尚不明確。 彗星熒光原位雜交技術(Comet assay combined with fluorescence in situ hybridization, Comet-FISH)是彗星實驗和熒光原位雜交技術的結合,是一種在單細胞水平檢測特定基因損傷和修復的有效方法,目前主要應用于遺傳毒物對抑癌基因TP53影響的研究中。本研究擬通過采用該技術來檢測胚胎植入期CS2暴露對小鼠子宮內膜細胞LIF基因完整性的影響,從而在基因水平上揭示CS2暴露致LIF蛋白及mRNA表達水平降低的機制,并從DNA水平解釋胚胎植入期CS2暴露致胚胎植入數(shù)目減少的原因。 研究目的 構建胚胎植入期不同時點暴露與CS2的動物模型,觀察不同時點CS2暴露對孕鼠母體及胚胎的影響；檢測敏感暴露時點的不同觀察終點孕鼠子宮內膜細胞DNA損傷的時間變化規(guī)律,并檢測各觀察終點LIF基因的斷裂情況,以期在DNA水平上探討胚胎植入期CS2暴露致胚胎植入數(shù)目減少的機制。 研究方法 1.建立動物模型 SPF級性成熟昆明種小鼠適應性喂養(yǎng)一周后,按雌雄1：1交配合籠,次日晨8點檢查陰栓,陰栓陽性者記為孕第1天(GD1)。將孕鼠隨機分為8個組：4個暴露組{4種暴露時間，即受孕后第3天(GD3)、第4天(GD4)、第5天(GD5)和第6天(GD6)}和4個相應的對照組，各有12只孕鼠。按631.4mg/kg(0.4LD50)的劑量在設定的暴露時點給予孕鼠一次性腹腔注射CS2溶液,對照組給予等體積的橄欖油。各組孕鼠均于受孕后第9天脫臼處死,稱取子宮、卵巢、肝、脾、腎、胚胎等的重量,并計數(shù)胚胎植入數(shù)目。 在上述動物模型中選定胚胎植入數(shù)目減少最明顯的暴露時間作為機制研究的暴露時點。將孕鼠隨機分為14個組：CS2暴露組和溶劑對照分別包括7個觀察時點(即暴露后6h、12h、18h、24h、2d、3d和5d)組。暴露劑量和溶劑同前。 2.子宮內膜細胞的收集 在每個觀察時點將孕鼠脫臼處死,采用機械刮取法直接刮取孕鼠子宮內膜,反復吹打制成單細胞,計數(shù)細胞存活率并調整細胞密度至2×105～4×105個/ml。 3.檢測孕鼠子宮內膜細胞DNA損傷 建立適用于檢測小鼠子宮內膜細胞損傷的彗星實驗條件和方法,檢測CS2暴露后各觀察時點孕鼠子宮內膜細胞DNA損傷情況。 4.檢測孕鼠子宮內膜細胞LIF基因斷裂情況 訂制與LIF基因相結合的熒光標記探針,采用Comet-FISH實驗技術檢測CS2暴露后各觀察時點孕鼠子宮內膜細胞LIF基因斷裂情況。 5.統(tǒng)計分析方法 采用Excel建立數(shù)據(jù)庫,使用SPSS16.0進行統(tǒng)計分析,測量指標均以x±s表示。各組指標之間首先進行方差齊性檢驗；若方差齊,采用單因素方差分析(ONE-WAY ANOVA)進行F檢驗,差異有顯著性時采用Dunnett-t test進行暴露組與對照組均數(shù)差異的顯著性檢驗；若方差不齊,采用非參數(shù)統(tǒng)計Kruskal-Wallis Test進行組間比較,Mann-Whitney Test進行兩兩比較。統(tǒng)計學檢驗水準設定為a=0.05。 研究結果 1.胚胎植入期CS2暴露對孕鼠母體及胚胎的毒性作用 母體毒性：孕鼠在胚胎植入期不同時點暴露于CS2,各暴露組孕鼠的GD9體重和體重增重與對照組相比,差異均沒有統(tǒng)計學意義。與對照組相比,各暴露組孕鼠子宮、卵巢、肝臟、脾臟及腎臟重量均無統(tǒng)計學差異,各暴露組孕鼠的肝臟、脾臟及腎臟系數(shù)也沒有統(tǒng)計學意差異；而GD4暴露組的子宮系數(shù)和GD5暴露組的卵巢系數(shù)與對照組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。此結果提示,胚胎植入期暴露于CS2對孕鼠的生殖器官有一定的影響,具有一定的生殖毒性。 胚胎毒性：GD4和GD5暴露組的胚胎植入數(shù)目和胚胎窩重與對照組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),GD4和GD5暴露組的胚胎植入數(shù)目較對照組分別減少了93.65%和90.44%,胚胎窩重也明顯低于對照組,但校正胚胎植入數(shù)目后胚胎均重與對照組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。 2.胚胎植入期CS2暴露對孕鼠子宮內膜細胞DNA損傷的影響 GD4孕鼠暴露于CS2,在暴露后的6h、12h、18h、24h和2d,反映孕鼠子宮內膜細胞DNA損傷的各項指標(TDNA%、TL、TM和OTM)與對照組相比,均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。CS2暴露后的18h其DNA損傷程度最明顯,且TDNA%、TL、TM和OTM與胚胎植入數(shù)目之間存在相關性,相關性系數(shù)r分別為-0.863、-0.934、-0.804和-0.847,且均具有統(tǒng)計學意義(P0.01)。在暴露后的3d和5d,孕鼠子宮內膜細胞的DNA損傷情況對對照組相比均沒有統(tǒng)計學差異。 3.胚胎植入期CS2暴露對孕鼠子宮內膜細胞LIF基因完整性的影響 GD4孕鼠暴露于CS2,應用Comet-FISH技術檢測與LIF基因相結合的熒光標記探針信號。除暴露后18h以外,各觀察時點檢測到的熒光信號均出現(xiàn)在彗星頭部,但暴露后18h在彗星尾部檢測到熒光信號，說明暴露于CS2后可導致子宮內膜細胞LIF基因發(fā)生斷裂。 結論 1.胚胎植入期CS2暴露可導致明顯的胚胎毒性,主要表現(xiàn)為胚胎植入數(shù)目明顯減少,而且GD4是胚胎植入期CS2暴露致胚胎毒性的敏感時點。 2.DNA損傷是胚胎植入障礙的重要機制之一。GD4孕鼠暴露于CS2后至18h內DNA損傷程度逐漸增強,18h時達到最高值；18h后DNA損傷程度逐漸恢復到正常水平,子宮內膜細胞DNA損傷呈現(xiàn)出明顯的時間變化規(guī)律。此外,DNA損傷程度與胚胎植入數(shù)目之間存在明顯的負相關關系。 3.CS2暴露后18h是LIF基因損傷的敏感時點。在CS2暴露后18h的孕鼠子宮內膜細胞中發(fā)現(xiàn)LIE基因斷裂，且暴露后18hDNA損傷最為明顯。這可能是導致GD4暴露LIF mRNA和蛋白表達水平均降低的重要原因之一。
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【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R114

【參考文獻】

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本文編號：1737588