本文關鍵詞： Pb~(2+) 鈣離子 SOC 細胞凋亡 HEK293　出處：《南方醫(yī)科大學》2012年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：背景 鉛在環(huán)境中大量存在,廣泛分布,已經成為常見的工業(yè)和環(huán)境毒物。鉛被用做汽油添加劑,導致了嚴重的大氣污染,鉛還作為增白劑使用于化妝品等。鉛在工業(yè)上是一種重要的化學物質,而在人體內卻是一種有害的物質。眾多的研究表明鉛對人體健康可產生持續(xù)的、慢性損傷。近年來,環(huán)境污染特別是鉛的污染受到社會各界的廣泛重視,其導致的疾病及致病機制是我們關注的熱點,人們致力于防治鉛毒害,減少或減輕鉛毒害。 細胞凋亡是在人和動物的多種組織中發(fā)現(xiàn)的一種程序性細胞死亡過程,可在機體的正常生理過程中存在,與生長、分化同樣重要,是當今生物和醫(yī)學科學領域中的新興課題與熱點。目前的研究表明,金屬元素可以誘導細胞凋亡的發(fā)生,并表現(xiàn)出與凋亡具有較為復雜的關系。因此近年來有關金屬元素與細胞凋亡的研究日益受到重視。 細胞內鈣濃度的升高或下降可引起一系列細胞生物學反應,如神經遞質分泌、骨骼肌收縮等快速反應,以及細胞分化、有絲分裂、細胞凋亡等慢速反應。研究顯示,無論是在早期還是晚期細胞內鈣濃度的升高都有促細胞凋亡作用。 [Ca2+]i升高導致細胞凋亡的機制尚不十分清楚,可能與下列途徑有關：(1)導致DNA損傷：首先,[Ca2+]i升高可通過激活Ca2+/Mg2+依賴性核酸內切酶,導致DNA的斷裂。其次[Ca2+]i升高可能通過某些機制(如組蛋白I重新分布和拓撲異構酶Ⅱ活化)而影響染色體的結構,使之出現(xiàn)解折疊,扭轉張力減低和超螺旋構象的改變,而使DNA易于被DNase降解。(2)作用于非DNA結構：如激活蛋白酶和谷氨酰胺轉移酶,前者可進一步激活或修飾細胞骨架蛋白和某些蛋白激酶,導致細胞骨架的降解；后者正常時在胞質蛋白和膜結合蛋白間起交聯(lián)作用,凋亡時活性增高,尤以凋亡小體中增高最明顯,不僅與凋亡細胞的形態(tài)變化有關,而且可能通過交聯(lián)而形成的鋼性網架,使質膜的抗溶解能力增強,從而保持細胞膜的完整性,防止細胞內容物的外漏。 鈣池操縱的通道(store-operated calcium channels, SOCs)廣泛存在于非興奮性細胞膜上,是胞外內流的主要通道之一,參與多種病理和生理過程。SOCs的研究對于進一步完善非興奮性細胞的鈣通道特性及其調節(jié)機制的理論具有重要意義,并為臨床解決諸如肝細胞鈣超載等難題提供有力的理論和實驗依據(jù),因此受到越來越廣泛的重視。積極尋找和應用SOCs的特異性工具藥,不但對非興奮性細胞SOCs的鑒定和深入研究非常必要,而且將為開發(fā)一類非興奮性細胞的特異性鈣拮抗劑奠定基礎。 因此,本研究主要探討乙酸鉛(Lead acetate)處理體外培養(yǎng)細胞,觀察其對培養(yǎng)細胞是否通過SOCs影響鈣紊亂從而發(fā)揮毒性效應,為進一步研究鉛毒性的分子機制提供數(shù)據(jù)。 方法 1.將人胚胎腎細胞HEK293置于5%CO2,37℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng),分別以O、50、100、200、500μM鉛(Pb2+)處理細胞24小時后,使用流式細胞技術檢測不同濃度組細胞凋亡變化情況。 2.用hoechst33342染色方法檢測鉛處理人胚胎腎細胞HEK293后細胞核形態(tài)學變化情況。 3.不同濃度鉛處理細胞24小時后,應用電感耦合等離子體質譜(ICP-MS)檢測,不同濃度組胞內Pb2+含量。 4.使用激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM),記錄細胞在鉛刺激下,胞質及細胞器內質網中鈣離子的變化情況。 結果 1.不同濃度鉛(Pb2+)誘導HEK293細胞凋亡率的影響 分別以0、50、100、200、500μM鉛(Pb2+)處理HEK293細胞24小時后,流式細胞儀檢測細胞凋亡率,結果顯示,各濃度組Pb2+處理24小時后細胞凋亡率與對照組相比顯著升高(P0.01)。以上結果表明,Pb2+可誘導HEK293細胞凋亡,并具有劑量反應關系。 2.鉛(Pb2+)誘導HEK293細胞發(fā)生凋亡的形態(tài)學表現(xiàn) 用hoechst33342染色方法檢測鉛處理HEK293細胞后細胞核形態(tài)變化。結果顯示100μMPb2+作用HEK293細胞24小時后,HEK293細胞核出現(xiàn)明顯的核濃縮、染色質片段等細胞凋亡的特征性表現(xiàn),并形成典型的凋亡小體。 3.不同濃度Pb2+處理HEK293細胞,進入胞內的Pb2+含量測定 Pb2+進入細胞的方式與Ca2+相似,我們的研究證明,應用ICP-MS法檢測不同濃度的鉛處理組,胞內鉛含量與胞外鉛處理組呈濃度依賴性。然而使用SOC的抑制劑2-APB顯著降低鉛的進入量。 4.不同條件下,胞質及內質網中游離Ca2+變化情況 在胞外有鈣的情況下,用不同濃度的Pb2+刺激HEK293細胞,用激光掃描共聚焦實時監(jiān)測胞質中游離Ca2+發(fā)現(xiàn),隨著胞外Pb2+的升高,胞質中游離Ca2+的升高幅度也相應增高,且呈濃度依賴性。 在胞外有鈣的情況下,使用SOC的阻斷劑2-APB預孵后,再用100μMPb2+刺激發(fā)現(xiàn),2-APB孵育組與對照組相比,胞質中游離Ca2+增幅度明顯減小,說明胞質中游離Ca2+增加可能來自胞外游離鈣。 在胞外有鈣和無鈣的情況下,分別用100μM Pb2+刺激發(fā)現(xiàn),胞外無鈣組與胞外有鈣組相比,胞質中游離Ca2+增幅度下降,也說明胞質中游離Ca2+增加可能來自胞外游離鈣。 在胞外無鈣的情況下,同樣用100μM Pb2+刺激細胞,監(jiān)測鈣庫內質網中游離Ca2+濃度變化發(fā)現(xiàn),內質網中游離Ca2+濃度明顯下降,說明鈣庫內質網中的游離Ca2+外排,使得胞質中游離Ca2+濃度增加。 結論 本研究的實驗結果顯示,Pb2+可誘導非興奮性HEK293細胞胞質中游離Ca2+的濃度升高,可能通過鈣庫鈣的釋放,且激活胞外鈣離子的內流而導致的,即通過SOC通路使得胞外鈣內流,再加上胞外鉛離子的進入,共同促進細胞的凋亡。說明SOC介導的細胞外鈣、鉛內流在Pb2+誘導HEK293細胞凋亡過程中發(fā)揮一定作用。
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【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R114

【參考文獻】

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本文編號：1496767