本文關(guān)鍵詞： 赭曲霉毒素A 自噬 氧化損傷 ATM/LKB1/AMPK　出處：《遵義醫(yī)學(xué)院》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:探討赭曲霉毒素A(OTA)誘導(dǎo)的腎細胞(HEK293T細胞)氧化應(yīng)激以及該過程與自噬的關(guān)系。方法:以HEK293T細胞為實驗對象,通過OTA對細胞進行染毒,運用CCK-8增強型試劑盒對細胞活性進行檢測;運用活性氧檢測試劑盒檢測ROS表達水平;通過Western blot檢測自噬通路中關(guān)鍵蛋白(p-ULK1、p-Beclin1、p-mTOR、LC3-B)和氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白(ATM/LKB1/AMPK通路及TRAP1、VDAC1和LONP1)的表達情況。結(jié)果:1.OTA處理HEK293T細胞24小時后CCK-8結(jié)果表明:與對照組(不予以任何處理)相比1μM、3μM和5μM組均促進細胞生長,細胞存活率分別是105.1%、121.7%和121.3%;7μM、8μM、9μM及10μM組表現(xiàn)為抑制細胞生長,其中7μM組細胞存活率為89.6%,8μM組細胞存活率為49.4%,9μM組細胞存活率為10.5%,10μM組細胞存活率為5.7%。2.Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白結(jié)果顯示OTA處理組中p-ULK1、p-Beclin1以及LC3B蛋白的表達明顯高于對照組(不予以任何處理),該結(jié)果表明OTA誘導(dǎo)了HEK293T細胞自噬的發(fā)生,且8μM組自噬發(fā)生的水平高于7μM組。同時,8μM組及7μM組TRAP1、VDAC1和LONP1蛋白表達均明顯低于對照組(不予以任何處理)。表明7μM和8μM OTA處理HEK293T細胞抑制了TRAP1、VDAC1和LONP1蛋白的表達。3.活性氧檢測試劑盒檢測結(jié)果表明OTA誘導(dǎo)細胞ROS水平升高,其中8μM組ROS熒光強度(?)=138.33,7μM組ROS熒光強度(?)=37.70,對照組(不予以任何處理)熒光強度(?)=1.36。4.與對照組(不予以任何處理)比較8μM組p-ATM、p-LKB1和p-AMPK蛋白表達明顯增高,7μM組p-ATM、p-LKB1和p-AMPK蛋白的表達無明顯變化,該結(jié)果表明8μM OTA誘導(dǎo)細胞氧化應(yīng)激激活了ATM/LKB1/AMPK信號通路。5.與對照組(不予以任何處理)比較7μM組p-mTOR蛋白表達無明顯變化,8μM組p-mTOR蛋白的表達明顯低于對照組(不予以任何處理)。結(jié)論:(1)OTA處理誘導(dǎo)了HEK293T細胞氧化應(yīng)激的發(fā)生,并且誘導(dǎo)了自噬發(fā)生,其中8μM處理誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激進一步激活A(yù)TM/LKB1/AMPK信號通路。(2)OTA處理抑制了HEK293T細胞TRAP1蛋白、LONP1蛋白及VDAC1蛋白的表達。
[Abstract]:Objective: to investigate the oxidative stress induced by ochratoxin (ACTA) in renal cell line HEK293T and its relationship with autophagy. Methods: HEK293T cells were used as experimental subjects. The cells were poisoned by OTA and the activity of the cells was detected by CCK-8 enhanced kit. The expression of ROS was detected by reactive oxygen species assay kit. Western blot was used to detect p-ULK1, p-Beclin1 and p-mTOR in autophagy pathway. LC3-B) and oxidative stress-related protein, ATM / LKB1 / AMPK pathway and TRAP1. The expression of VDAC1 and LONP1. Results: 1. The CCK-8 of HEK293T cells treated with OTA for 24 hours showed that it was not treated with any treatment. Compared with 1 渭 M. The cell growth was promoted in 3 渭 M and 5 渭 M groups, the cell survival rate was 105.1% and 121.3%, respectively. The cell growth was inhibited in 7 渭 M 8 渭 M 9 渭 M and 10 渭 M groups. The cell survival rate of 7 渭 M group was 89.6 渭 M and the cell survival rate of 8 渭 M group was 49.4%. The cell survival rate of 9 渭 M group was 10.5%. The cell survival rate of 10 渭 M group was 5.7. 2. The results of the detection of autophagy associated protein by Western blot showed that p-ULK1 was in the OTA treatment group. The expression of p-Beclin1 and LC3B protein was significantly higher than that of the control group (without any treatment), which indicated that OTA induced autophagy of HEK293T cells. The level of autophagy in 8 渭 M group was higher than that in 7 渭 M group, and TRAP1 in 8 渭 M group and 7 渭 M group was higher than that in 7 渭 M group. The expression of VDAC1 and LONP1 protein was significantly lower than that of the control group (no treatment was given, indicating that 7 渭 M and 8 渭 M OTA treatment of HEK293T cells inhibited TRAP1. The expression of VDAC1 and LONP1 protein. 3. The results of reactive oxygen species detection kit showed that OTA induced the increase of ROS level, especially in 8 渭 M group, ROS fluorescence intensity? Fluorescence intensity of ROS in 138.33 渭 M group? The fluorescence intensity of the control group (without any treatment) was 37. 70? Compared with the control group (without any treatment), the expression of p-ATMN p-LKB1 and p-AMPK protein in 8 渭 M group was significantly higher than that in the control group (7 渭 M group), and the expression of p-AMPK protein in 7 渭 M group was significantly higher than that in 7 渭 M group. The expression of p-LKB1 and p-AMPK protein did not change significantly. The results showed that 8 渭 M OTA induced oxidative stress activated ATM/LKB1/AMPK signaling pathway. 5. There was no significant change in p-mTOR protein expression in 7 渭 M group. The expression of p-mTOR protein in 8 渭 M group was significantly lower than that in the control group (no treatment was given). And induced autophagy. The oxidative stress induced by 8 渭 M further activated the ATM/LKB1/AMPK signaling pathway. OTA treatment inhibited the TRAP1 protein in HEK293T cells. Expression of LONP1 protein and VDAC1 protein.
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R114

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本文編號：1452925