本文關(guān)鍵詞：氧化應(yīng)激在亞砷酸鈉誘導(dǎo)人永生化角質(zhì)形成細胞（HaCaT）適應(yīng)性反應(yīng)中的意義

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【摘要】：目的探討低劑量亞砷酸鈉染毒誘導(dǎo)人永生化角質(zhì)形成細胞(Human HaCaTKeratinocytes, HaCaT)適應(yīng)性反應(yīng)中氧化應(yīng)激和Keap1/Nrf2-ARE信號通路的表達及其意義。 方法 1．染毒劑量確定：以HaCaT細胞為研究對象，用0.1、0.15、0.6、2.5、5.0、10.0、20.0和40.0μM亞砷酸鈉(NaAsO2)進行細胞染毒，采用MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒檢測細胞增殖率。通過增殖曲線和GraphPad Prism6軟件計算亞砷酸鈉染毒半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration, IC50），從而確定后續(xù)誘導(dǎo)適應(yīng)性反應(yīng)實驗的預(yù)處理劑量和沖擊劑量。 2．實驗分組：將用于實驗的HaCaT細胞分為預(yù)處理組和無預(yù)處理組。預(yù)處理組HaCaT細胞在加入含0.15μM亞砷酸鈉的細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)24h后，換用含10μM亞砷酸鈉的細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)0、4、8、12、24和36h；無預(yù)處理組待HaCaT細胞處于生長對數(shù)期時，直接換用含10μM亞砷酸鈉的細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)0、4、8、12、24和36h。 3.氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測：實驗染毒終點收集細胞，采用流式細胞儀檢測HaCaT細胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平，采用ELISA方法檢測HaCaT細胞內(nèi)丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量的變化。 4. Keap1/Nrf2-ARE抗氧化通路相關(guān)蛋白檢測：實驗染毒終點收集細胞，通過Western blot方法檢測Keap1/Nrf2-ARE信號通路發(fā)揮抗氧化作用的關(guān)鍵蛋白核轉(zhuǎn)錄因子紅細胞系-2p45(NF-E2)相關(guān)因子-2(nuclear factor erythroid-2p45-relatedfactor2, Nrf2)、Nrf2的胞漿抑制蛋白Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(Kelch-likeECH-associated protein1, Keap1)和Nrf2的胞核競爭蛋白BTB-CNC異體同源體1(BTB and CNC homology1, BACH1)在HaCaT細胞胞漿和胞核中的表達情況，以及HaCaT細胞中抗氧化相關(guān)酶類的表達情況，包括血紅素單加氧酶(hemeoxygenase1, HO-1)蛋白水平和細胞總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活力改變情況。 結(jié)果 1．不同劑量亞砷酸鈉對HaCaT細胞增殖的影響：與無預(yù)處理組相比，≤2.5μM亞砷酸鈉染毒組HaCaT細胞相對增殖率增加，其中0.15μM組的增殖率增加最明顯，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；大于2.5μM亞砷酸鈉染毒組HaCaT細胞相對增殖率明顯減小(P0.05)，計算得亞砷酸鈉IC50為9.077μM。 2．低劑量亞砷酸鈉誘導(dǎo)HaCaT細胞ROS和MDA的改變：隨著亞砷酸鈉染毒時間的延長，預(yù)處理組HaCaT細胞內(nèi)ROS和MDA水平先上升后下降，其中ROS水平在12h達到峰值，MDA水平在24h達到峰值，均比無預(yù)處理組ROS和MDA水平達到峰值時間（分別為8h和12h）要延后，并且ROS和MDA的峰值水平顯著低于無預(yù)處理組(P0.05)。 3．低劑量亞砷酸鈉誘導(dǎo)HaCaT細胞Keap1/Nrf2-ARE通路表達的改變： （1）亞砷酸鈉染毒不同時間對轉(zhuǎn)錄因子Nrf2蛋白水平的影響：隨著亞砷酸鈉染毒時間的延長，預(yù)處理組HaCaT細胞核中Nrf2蛋白水平隨染毒時間延長呈先下降后上升趨勢，在8h達到峰值，峰值時間比無預(yù)處理組（12h）提前，并且峰值水平高于無預(yù)處理組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；另外，預(yù)處理組細胞核Nrf2蛋白在8h的水平明顯高于同時間點無預(yù)處理組(P0.05)。預(yù)處理組HaCaT細胞漿中Nrf2蛋白水平隨染毒時間延長而增加，在8h達到峰值，在8、12和36h的蛋白水平顯著高于無預(yù)處理組(P0.05)。 （2）亞砷酸鈉染毒不同時間對HO-1蛋白水平和SOD酶活力的影響：隨著亞砷酸鈉染毒時間的延長，HaCaT細胞內(nèi)HO-1蛋白水平增加，呈先上升后下降趨勢，在8、12、24和36h的HO-1水平皆顯著高于0h組(P0.05)。預(yù)處理組HO-1蛋白水平增加較快，在12h達到峰值，峰值時間較無預(yù)處理組(24h)提前。預(yù)處理組HaCaT細胞內(nèi)SOD水平先下降后上升，在12h達到峰值，較無預(yù)處理組達峰值時間(8h)延遲，SOD酶活力峰值水平高于無預(yù)處理組峰值，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；另預(yù)處理組SOD酶活力水平在0、8、12和24h時間點均明顯高于無預(yù)處理(P0.05)。 （3）亞砷酸鈉染毒不同時間對Keap1和BACH1蛋白水平的影響：隨著亞砷酸鈉染毒時間的延長，預(yù)處理組HaCaT細胞漿中Keap1蛋白水平先上升后下降，在0、24和36h的表達水平皆低于無預(yù)處理組，，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。預(yù)處理組HaCaT細胞核中Keap1在8h達到峰值，峰值時間比無預(yù)處理組（12h）提前，并且峰值水平明顯高于無預(yù)處理組(P0.05)；另外，預(yù)處理組細胞核Keap1蛋白在8h和12h的表達水平顯著高于同時間點無預(yù)處理組(P0.05)。 隨著亞砷酸鈉染毒時間的延長，預(yù)處理組HaCaT細胞漿中BACH1蛋白水平呈先上升后下降趨勢，在8h達到峰值，峰值時間比無預(yù)處理組（24h）提前，并且BACH1蛋白在4和8h的表達水平均高于無預(yù)處理組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。預(yù)處理組HaCaT細胞核中BACH1蛋白水平隨染毒時間延長而增加，在8h達到峰值，達到峰值時間比無預(yù)處理組（24h）提前，并且峰值水平明顯高于無預(yù)處理組(P0.05)；另預(yù)處理組細胞核BACH1在8h的表達水平顯著高于同時間點無預(yù)處理組(P0.05)。 結(jié)論 低劑量亞砷酸鈉染毒誘導(dǎo)HaCaT細胞適應(yīng)性反應(yīng)過程中啟動Keap1/Nrf2-ARE信號通路，降低后續(xù)高劑量亞砷酸鈉導(dǎo)致的氧化應(yīng)激水平。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R114

【參考文獻】

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本文編號：1226818