本文關(guān)鍵詞：ROS在硫酸鎳誘導(dǎo)大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和線粒體凋亡通路中的作用

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【摘要】：目的:通過(guò)體外培養(yǎng)大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞,觀察硫酸鎳致大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞ROS水平與細(xì)胞凋亡的關(guān)系,以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和線粒體凋亡通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的變化,探討ROS在鎳誘導(dǎo)大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和線粒體凋亡通路中的作用。方法:(1)采用0.25%膠原酶消化大鼠睪丸組織分離出睪丸間質(zhì)細(xì)胞,Percoll連續(xù)梯度分離液對(duì)其進(jìn)行純化,并采用貼壁培養(yǎng)法再次純化。通過(guò)3β-HSD對(duì)純化后的細(xì)胞進(jìn)行純度鑒定。(2)純化后的大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞,給予不同濃度(0、250、500和1000μmol/L)NiSO4分別處理0、6、12和24h,通過(guò)MTT法和LDH滲漏法檢測(cè)各組細(xì)胞存活率和培養(yǎng)液中LDH活力。(3)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期間質(zhì)細(xì)胞,經(jīng)自由基清除劑NAC和TEMPO提前干預(yù)1h后,再行500μmol/L NiSO4處理12h。采用DCFH-DA探針?lè)ㄓ^察大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)ROS水平,DAPI熒光染色法觀察細(xì)胞核形態(tài)學(xué)變化,Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。采用Western blot法檢測(cè)大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78、GADD153和Caspase-12,以及線粒體凋亡通路相關(guān)蛋白Bak、Cyt C、Caspase-9和Caspase-3的表達(dá)水平。結(jié)果:(1)純化的間質(zhì)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)24h后,通過(guò)3β-HSD染色法鑒定,可得到純度較高的間質(zhì)細(xì)胞。(2)與對(duì)照組比較,250、500和1000μmol/L NiSO4分別處理6、12和24h后,不同處理組細(xì)胞存活率均顯著下降(P0.05),細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH活力均顯著升高(P0.05),且隨著NiSO4處理濃度和時(shí)間的增加,細(xì)胞存活率逐漸降低,細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活力也逐漸升高。(3)與對(duì)照組比較,500μmol/L NiSO4處理12h組(NiSO4組)熒光顯微鏡下可見(jiàn)間質(zhì)細(xì)胞中ROS水平明顯升高。與NiSO4組比較,經(jīng)5mmol/L NAC(NAC組)和1mmol/L TEMPO(TEMPO組)干預(yù)后,間質(zhì)細(xì)胞中ROS水平明顯下降(P0.05)。DAPI熒光染色后,鏡下可見(jiàn)NiSO4組細(xì)胞體積變小,細(xì)胞核固縮或裂解,呈梭狀和鐮刀狀,部分染色質(zhì)呈現(xiàn)濃縮狀態(tài),可見(jiàn)凋亡小體;NAC組細(xì)胞核可見(jiàn)固縮,邊緣呈梭狀,不完整;TEMPO組細(xì)胞核大多為正常圓形,少見(jiàn)固縮和不完整邊緣的細(xì)胞核,凋亡小體明顯減少。流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè)細(xì)胞凋亡率發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組比較,NiSO4組間質(zhì)細(xì)胞凋亡率顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與NiSO4組比較,NAC組和TEMPO組間質(zhì)細(xì)胞凋亡數(shù)量均明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與對(duì)照組比較,NiSO4組間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78、GADD153和Caspase-12以及線粒體凋亡通路相關(guān)蛋白Bak、Cyt C、Caspase-9和Caspase-3的蛋白表達(dá)水平均升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與NiSO4組比較,NAC組細(xì)胞上述蛋白表達(dá)水平均下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而TEMPO組除Caspase-3以外,其他蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:NiSO4對(duì)大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的損傷可能與其誘導(dǎo)間質(zhì)細(xì)胞ROS大量生成和凋亡率增加有關(guān)。NiSO4可通過(guò)上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和線粒體凋亡通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平,但前述變化均可被自由基清除劑NAC和TEMPO所阻抑,表明ROS可能在硫酸鎳誘導(dǎo)的大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和線粒體凋亡通路中發(fā)揮重要作用。
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R114

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1 田金舉;陳禮儀;宋豐林;陳曦f，

本文編號(hào)：1220716