本文關鍵詞：基于功能嵌合適體和外切酶Ⅲ的汞和金屬硫蛋白生物傳感研究

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【摘要】：汞(mercury)是廣泛存在于自然界的一種重金屬污染物,在較低的濃度下,也能夠對生態(tài)環(huán)境和人類健康造成很大的威脅,是全球最引人關注的環(huán)境污染物之一。金屬硫蛋白(metallothioneins,MTs)是一類富含半胱氨酸的低分子量、熱穩(wěn)定性和可誘導型金屬結合蛋白,具有重金屬解毒、自由基清除、抗輻射及抑制腫瘤等重要的生物學功能。此外,金屬硫蛋白的表達是評價環(huán)境中重金屬污染的一種關鍵性的生物標志物。因此,建立簡便、快速、靈敏、實用的檢測汞離子和金屬硫蛋白的新方法對環(huán)境污染物監(jiān)測、職業(yè)健康風險評價以及金屬硫蛋白生物學功能的研究都具有重要意義。第一章前言部分介紹了汞和金屬硫蛋白的研究意義及檢測方法,并概述了G-四聚體(G quadruplex)DNAzyme和核酸外切酶III在生物傳感領域的應用。第二章建立了基于功能化的嵌合適體構象改變雙通道比色法檢測汞和金屬硫蛋白。實驗設計的功能嵌合適體包含一段富T及富G序列,在沒有汞離子(Hg2+)存在的情況下,可以形成完整的G 四聚體,結合氯化高鐵血紅素(hemin)后具有過氧化物酶活性,能催化過氧化氫(H2O2)氧化2,2' 聯(lián)氮 二 (3 乙基苯并噻唑啉 6 磺酸)二銨鹽(ABTS)發(fā)生顯色反應。加入Hg2+后,Hg2+特異性的識別富T序列形成t hg2+ t結構,導致嵌合適體發(fā)生構象改變,不能形成g quadruplex,催化活性降低,繼而引起體系顏色和吸光度的改變。加入mts后,mts通過巰基結合hg2+生成mts hg2+復合物,促使嵌合適體向g quadruplex轉變,體系的顏色和吸光度也隨之改變�；趃 quadruplex和t hg2+ t結構的構象轉換,我們建立了雙通道比色法測定汞和金屬硫蛋白的新方法。在優(yōu)化的實驗條件下,hg2+的濃度為8.84×10-9 1.0×10-6mol·l-1時,體系的?a與hg2+濃度有良好的線性關系。線性回歸方程為?a=0.0428+0.178c(×10-7mol·l-1),r=0.9963。mts的濃度為7.22×10-9 4.62×10-7mol·l-1時,體系的?a與mts濃度有良好的線性關系�；貧w方程為?a=0.0333+0.185c(×10-7mol·l-1),r=0.9995。汞和mts的檢出限分別為2.65×10-9mol·l-1和2.34×10 9mol·l-1。本文設計的方法簡單、靈敏度高、選擇性強、成本低,已成功應用于尿樣中痕量mts的測定。第三章基于核酸外切酶iii熒光放大技術建立了一種簡單、快速地檢測汞離子的新方法。課題設計了一條分子信標,5’端標記有6 羧基熒光素(6 carboxylfluorescein,6 fam)熒光基團,3’端游離出的連續(xù)3個g堿基可以猝滅5’端的熒光。當存在汞離子時,分子信標與適體鏈通過t hg2+ t配位結合,形成3’端齊平的雙鏈dna(dsdna),可以被核酸外切酶iii識別并進行剪切,釋放出熒光基團、汞離子和適體鏈,而被釋放出的汞離子及適體鏈繼續(xù)和新的分子信標雜交,“雜交 酶切 釋放”的過程不斷循環(huán),體系的熒光信號顯著增強。在優(yōu)化的實驗條件下,汞離子的濃度為1.0×10-9 4.68×10-8 mol·L-1時,體系的?F與汞離子濃度有良好的線性關系�；貧w方程為ΔF= 82.1+30.4c(×10-9 mol·L-1),r=0.9989,檢出限為3.0×10-10 mol·L-1。該方法已經成功應用于水樣品中汞離子濃度的檢測,回收率為95.8% 106.9%。
【關鍵詞】：金屬硫蛋白 汞 G 四聚體 分子信標 核酸外切酶III
【學位授予單位】：南華大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R114;TP212.3
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-13
• 主要縮寫符號與對照13-14
• 第一章 前言14-24
• 1.1 研究意義14-16
• 1.1.1 汞的污染及其危害14
• 1.1.2 金屬硫蛋白的理化性質和生理功能14-16
• 1.2 汞和金屬硫蛋白的檢測方法16-19
• 1.2.1 汞的檢測方法16-17
• 1.2.2 MTs的檢測方法17-19
• 1.3 G quadruplex DNAzyme在生物傳感領域的應用19-20
• 1.3.1 G quadruplex的結構和性質19
• 1.3.2 基于G quadruplex DNAzyme的生物傳感方法19-20
• 1.4 核酸外切酶III信號放大技術在生物傳感領域的應用20-21
• 1.5 本研究的主要內容21-24
• 第二章 基于功能嵌合適體雙通道比色法檢測汞和金屬硫蛋白24-40
• 2.1 引言24-25
• 2.2 實驗部分25-27
• 2.2.1 儀器與試劑25-26
• 2.2.2 檢測汞 (a) 和MTs (b) 的實驗方法26-27
• 2.3 結果與討論27-35
• 2.3.1 實驗設計和生物傳感原理27-28
• 2.3.2 紫外可見吸收光譜特征和構象轉換機制28-29
• 2.3.3 吸光度 時間曲線和圓二色譜結果分析29-30
• 2.3.4 實驗條件的優(yōu)化30-35
• 2.4 實驗共存物質對Hg2+和MTs檢測的影響35-36
• 2.5 標準曲線、檢出限及精密度36-37
• 2.6 樣品分析37-38
• 2.7 結論38-40
• 第三章 基于外切酶III輔助信號放大熒光法檢測汞40-52
• 3.1 引言40-41
• 3.2 實驗部分41-42
• 3.2.1 儀器和試劑41-42
• 3.2.2 實驗方法42
• 3.3 結果與討論42-50
• 3.3.1 實驗設計和信號放大原理42-43
• 3.3.2 熒光光譜特征和機制探討43-44
• 3.3.3 實驗條件的優(yōu)化44-49
• 3.3.4 共存物質的影響49-50
• 3.3.5 實驗的標準曲線、檢出限及精密度50
• 3.4 樣品分析50-51
• 3.5 結論51-52
• 參考文獻52-62
• 綜述 基于T Hg~(2+) T結構的汞生物傳感器研究進展62-78
• 參考文獻74-78
• 作者攻讀學位期間的科研成果78-80
• 致謝80

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本文編號：1013010