本文關鍵詞：二硫氨基甲酸肽吡咯烷抑制大鼠角膜新生血管形成的實驗研究

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【摘要】：研究背景 角膜新生血管(corneal neovascularization,CNV)是多種眼表疾病如感染性角膜炎、眼化學傷、熱燒傷、非感染性角膜變性的重要特征之一,也是角膜移植術后發(fā)生排斥反應的高危因素,是導致角膜盲的主要原因之一,角膜新生血管的防治對于治療眾多角膜疾病和預防角膜盲具有重大意義。 一直以來,眾多研究人員致力于角膜新生血管發(fā)病機制的實驗研究,試圖從發(fā)病機制上預防或治療角膜新生血管,遺憾的是到目前為止,其確切發(fā)生機制尚未完全闡明。目前治療角膜新生血管的藥物主要有類固醇激素、非甾體抗炎藥物、抗VEGF藥物、環(huán)孢霉素類藥物,但這些藥物多存在局部或全身毒副作用或者價格昂貴等不足。 二硫氨基甲酸肽吡咯烷(pyrrolidine dithiocarbamte,PDTC)是核因子-κB(muclear factor-KappaB,NF-κB)活化的特異性阻斷劑。近年的研究發(fā)現,NF-κB在非激活情況下,主要以p50/p65二聚體與NF-κB抑制單位IκB形成的三聚體化合物存在于細胞質中,當細胞受到細胞外刺激時,IκB發(fā)生磷酸化及降解,激活的NF-κB(p50/p65二聚體)得以從細胞質進入細胞核,從而促進多種炎癥細胞因子及免疫基因的轉錄,在眼科疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉歸中起著重要的作用。目前研究表明,PDTC在增生性糖尿病視網膜病變、脈絡膜新生血管、腫瘤等疾病的治療中起著一定的作用。但是PDTC對角膜新生血管的作用少有報道,且PDTC抑制新生血管增生的具體機制尚不明確。 因此,本課題以PDTC為研究對象,采用縫線誘導法建立大鼠角膜新生血管模型,觀察不同濃度PDTC對大鼠角膜新生血管的影響,篩選PDTC眼部作用的安全有效濃度；通過免疫組織化學方法檢測在PDTC藥物作用過程中p65、血管內皮生長因子(VEGF)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)在新生血管化角膜中的表達,探討其可能機制,為臨床對角膜新生血管的治療提供一定的參考。 第一部分觀察不同濃度PDTC對大鼠角膜新生血管作用的研究目的 觀察局部應用不同濃度PDTC滴眼液對縫線誘導的大鼠角膜新生血管的影響,探討PDTC的有效安全濃度。 方法 配制相應濃度PDTC滴眼液(1mg/ml,2mg/ml,4mg/ml)。將48只健康成年雌性SD大鼠隨機分成四組,均設定以右眼為實驗眼。建立縫線誘導大鼠角膜新生血管模型,并隨機分為A組(lmg/ml PDTC滴眼組),B組(2mg/ml PDTC滴眼組),C組(4mg/ml PDTC滴眼組),D組(PBS滴眼組)。各組均于右眼角膜縫線術后第1天開始使用相應不同濃度的滴眼液,每日4次,每次10μl。自縫線術后第1天開始,每日于裂隙燈顯微鏡下觀察各組大鼠角膜新生血管生長情況,于第5、7、14、21天每組隨機抽取3只大鼠測量CNV長度,運用公式計算CNV面積并攝影記錄。術后第14天,每組隨機抽取3只大鼠行角膜組織病理學檢查：腹腔注射麻醉,采用頸椎脫臼法處死,手術顯微鏡下摘除右眼眼球,剪下角膜組織,4%多聚甲醛溶液固定,石蠟包埋,做4μm連續(xù)切片,常規(guī)蘇木精-伊紅染色,以中性樹膠封片,光學顯微鏡下觀察并拍照。 結果 1.不同時間點各組CNV面積(mm2):A、B、C組角膜新生血管面積在各時間點均明顯小于D組(P0.01)。第5天時,A、B、C組之間兩兩相比無明顯差異(P0.05)；第7天時,A組角膜新生血管面積較B、C組密集,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01),B組與C組相比,差異無統(tǒng)計學意義(P0.1)；第14天時,A組角膜新生血管面積大于B、C組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01),B組與C組相比,差異無統(tǒng)計學意義(P0.1)；術后第14天至術后第21天,各組角膜新生血管生長面積變化不明顯,差異無統(tǒng)計學意義(P0.1)。 2.組織病理學觀察：第14天,A組可見角膜基質層變厚,結構紊亂,較密集新生血管管腔,管腔內可見紅細胞附著,全層角膜較密集炎性細胞浸潤；B組可見角膜基質層結構整齊,少許新生血管管腔,角膜內少量炎性細胞浸潤；C組角膜基質層結構較整齊,新生血管管腔稀疏,角膜全層炎性細胞浸潤少；D組角膜水腫增厚,基質層結構不清,大量新生血管管腔,管腔內可見充滿紅細胞,角膜全層見密集炎性細胞浸潤。 結論 大鼠角膜縫線術后局部應用1mg/ml、2mg/ml、4mg/ml濃度PDTC滴眼液有抑制角膜新生血管的作用；2mg/ml PDTC滴眼液為抑制角膜新生血管的有效安全濃度。 第二部分PDTC抑制大鼠角膜新生血管作用的機制研究 目的 觀察局部應用2mg/ml PDTC滴眼液對縫線誘導的大鼠角膜新生血管的抑制作用,檢測新生血管化大鼠角膜組織中p65、血管內皮生長因子(VEGF)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的表達,并探討其意義。方法 65只健康成年雌性SD大鼠,隨機抽取5只作為正常對照組,其余60只隨機分為A組(2mg/ml PDTC組)、B組(0.1%地塞米松磷酸鈉組)、C組(PBS對照組),每組20只。正常對照組不處理,其余實驗動物制作大鼠右眼角膜縫線模型,術后分別予2mg/mlPDTC、0.1%地塞米松磷酸鈉、PBS緩沖液點右眼,每日4次,每次10μl,連續(xù)21天。術后每天在裂隙燈顯微鏡下觀察大鼠角膜新生血管及縫線的變化,在角膜縫線術后第5、7、14、21天分別隨機抽取5只大鼠計算各組角膜新生血管面積并攝影記錄；于第14天隨機取每組5只大鼠,處死后取右眼角膜組織進行角膜組織病理切片觀察及免疫組織化學方法檢測角膜組織中p65、VEGF和TNF-α的表達。每張切片隨機取5個200倍視野計數陽性細胞數并拍照,采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析,計量資料用neans±S.D.表示,各組CNV面積比較用重復測量設計資料的方差分析(Reeated Measure ANOVA)；p65.VECF和TNF-α的表達量用單向方差分析(One-Way ANOVA),以P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。 結果 1.不同時間點各組CNV面積(mm2)：A組2mg/ml PDTC組、B組0.1%地塞米松磷酸鈉組在5、7、14、21天角膜新生血管面積分別為(5.66±1.07mm2,5.82±1.28mm2)；(11.96±1.87mm2,10.78±2.02mm2)；(13.16±2.35mm2,14.97±1.52mm2):(14.39±2.35mm2,14.98±2.02mm2),各時間點兩組相比差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。C組PBS對照組在5、7、14、21天角膜新生血管面積分別為(12.96±2.12mm2)；(21.45±2.78mm2)；(32.34±2.54mm2)；(34.12±1.73mm2),各時間點新生血管面積大于A組與B組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。 2.組織病理學觀察：大鼠角膜縫線術后第14天,正常角膜可見角膜組織結構清晰,上皮細胞層排列整齊,角膜基質層膠原纖維排列規(guī)則,內皮層單層扁平細胞排列有序；A組可見角膜組織結構較整齊,角膜基質層散在新生血管形成,管腔較小,腔內少量紅細胞,少量淋巴細胞浸潤；B組角膜組織結構趨于完整,實質層散在新生血管,少量淋巴細胞浸潤；C組角膜實質層膠原基質腫脹,板層間隙增寬,基質內較密集新生薄壁血管,以中前部為多,管腔內見較多紅細胞,角膜實質層大量淋巴細胞浸潤。 3.p65.VEGF和TNF-α免疫組織化學圖像分析：活化的NF-κB主要在細胞核中以p65形式表達,VEGF和TNF-a表達于胞膜胞漿中。正常對照眼無新生血管,p65、VEGF和TNF-a僅在角膜上皮層和基質層有少量微弱的表達；大鼠角膜縫線術后第14天,A組、B組新生血管稀少,p65、VEGF和TNF-α在角膜上皮層、內皮層及基質層少量表達；C組新生血管密度增高,p65、VEGF和TNF-α表達增多。在各組可觀察到p65的表達強度與VEGF和TNF-α的表達強度有著明顯的一致性。 4.p65、VEGF和TNF-α免疫組織化學陽性細胞計數：術后14天,各組角膜p65、VEGF和TNF-α陽性細胞計數統(tǒng)計學分析結果表明,各組間p65、VEGF和TNF-α的表達不全相等,A、B、C組較正常角膜組陽性細胞數增多有顯著性差異(P0.05),C組p65、VEGF和TNF-α的表達相對A、B組較高(P0.05),但A、B組間比較,角膜p65、VEGF和TNF-α的表達無明顯差異(P0.1)。 結論 局部應用PDTC滴眼劑抑制角膜血管新生的機制可能與減少細胞核中p65的表達,降低新生血管化大鼠角膜中VEGF和TNF-α的表達有關。
【關鍵詞】：角膜 新生血管 二硫氨基甲酸肽吡咯烷 核因子-κB 血管內皮生長因子 腫瘤壞死因子-α
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R772.2
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-15
• 前言15-20
• 第一部分 觀察不同濃度PDTC對大鼠角膜新生血管作用的研究20-34
• 1 材料20-22
• 2 方法22-24
• 3 結果24-29
• 4 討論29-34
• 第二部分 PDTC抑制大鼠角膜新生血管作用的機制研究34-49
• 1 材料34-36
• 2 方法36-39
• 3 結果39-45
• 4 討論45-49
• 全文總結與展望49-50
• 參考文獻50-57
• 綜述57-68
• 參考文獻64-68
• 攻讀碩士期間發(fā)表的論文68-69
• 致謝69-70

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前10條

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6 李之U，

本文編號：988901