本文關(guān)鍵詞：LMP1瞬時過表達對鼻咽癌CNE2細胞遷移的影響及其作用機制的探討

  更多相關(guān)文章： LMP1 鼻咽腫瘤 真核表達載體 瞬時轉(zhuǎn)染 腫瘤遷移 rac1GTP結(jié)合蛋白質(zhì)

【摘要】：目的:鼻咽癌是我國南方高發(fā)惡性腫瘤，EB病毒感染幾乎與所有未分化和低分化鼻咽癌都有關(guān)，EB病毒編碼的潛伏膜蛋白1(latent membraneprotein1，LMP1)是近年研究病毒在人類致癌作用中受到關(guān)注的蛋白。LMP1蛋白可控制細胞的增殖和凋亡，使上皮細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化，，對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移產(chǎn)生重要影響，但其相關(guān)的信號通路較為復雜，具體機制尚不明了。本研究構(gòu)建可在真核細胞中表達LMP1的增強熒光表達載體，觀察其在鼻咽癌細胞CNE2中的表達，探討潛伏膜蛋白LMP1瞬時過表達對CNE2細胞遷移的影響及其作用機制，以期為豐富鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的分子機制提供一定的理論和實驗基礎(chǔ)。 方法:根據(jù)GenBank中LMP1基因mRNA全長序列設(shè)計合成引物，Trizol法提取人鼻咽癌細胞株C15的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR技術(shù)擴增出目的片段。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后分離，切膠回收純化，獲得LMP1基因片段。LMP1基因片段經(jīng)雙酶切亞克隆到pEGFP-C1質(zhì)粒載體，構(gòu)建pEGFP-C1-LMP1真核表達載體。重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切和測序鑒定。利用脂質(zhì)體介導的方法將pEGFP-C1-LMP1體外瞬時轉(zhuǎn)染鼻咽癌CNE2細胞，激光共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染細胞中LMP1蛋白的表達情況及其在細胞內(nèi)定位。CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-LMP1后鼻咽癌CNE2細胞的生長活力。流式細胞術(shù)檢測細胞周期。Transwell小室觀測轉(zhuǎn)染后CNE2細胞遷移和侵襲能力的變化。實時熒光定量PCR及蛋白印跡技術(shù)檢測LMP1及細胞遷移運動相關(guān)因子Rac1mRNA和蛋白的表達情況。 結(jié)果:重組載體經(jīng)Sal和BglⅡ雙酶切后，行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，可見一條與理論預測值（1170bp）一致的目的條帶。DNA序列鑒定證實插入片段與GenBank提供的序列一致。將pEGFP-C1-LMP1瞬時轉(zhuǎn)染鼻咽癌細胞株CNE2后，激光共聚焦顯微鏡下可見GFP對照組綠色熒光蛋白廣泛分布在胞漿中，而GFP-LMP1主要定位于CNE2細胞的胞膜和部分胞漿中。CCK-8實驗顯示，與GFP對照組相比，pEGFP-C1-LMP1轉(zhuǎn)染組細胞活力增強（P＜0.05）。流式細胞術(shù)檢測顯示：pEGFP-C1-LMP1組與GFP對照組相比，在G1、S期細胞數(shù)有差異（P＜0.05）。細胞侵襲實驗GFP對照組和pEGFP-C1-LMP1轉(zhuǎn)染組所測OD值分別為:0.1160±0.009，0.066±0.0097，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。在遷移實驗中，GFP對照組和pEGFP-C1-LMP1轉(zhuǎn)染組發(fā)生遷移的細胞個數(shù)分別為:99.3±13.05和63.0±8.54，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。Real-time PCR顯示：和GFP組相比， pEGFP-C1-LMP1轉(zhuǎn)染組LMP1mRNA的表達量明顯增高，Rac1mRNA表達降低；PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示，在導入LMP1的CNE2細胞中可見一明顯條帶，而GFP組未見，Rac1mRNA在pEGFP-C1-LMP1轉(zhuǎn)染組中的表達較GFP組明顯減弱。免疫印跡顯示LMP1蛋白的表達在GFP對照組呈陰性,而在目的基因轉(zhuǎn)染組呈陽性；目的基因轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染后24h可檢測到LMP1的表達，48h表達升高，72h后表達略為減弱，而Rac1則在目的基因轉(zhuǎn)染后的48h和72h表達均出現(xiàn)下調(diào)。 結(jié)論：成功構(gòu)建pEGFP-C1-LMP1真核表達載體，并在LMP1陰性的人類低分化鼻咽癌CNE2細胞株中表達。LMP1瞬時過表達可抑制鼻咽癌細胞CNE2的侵襲和遷移，可能與Rac1表達下調(diào)有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：LMP1 鼻咽腫瘤 真核表達載體 瞬時轉(zhuǎn)染 腫瘤遷移 rac1GTP結(jié)合蛋白質(zhì)
【學位授予單位】：桂林醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R739.63
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-10
• 英漢縮略詞對照表10-12
• 前言12-14
• 1 材料與方法14-45
• 2 結(jié)果45-53
• 3 討論53-61
• 4 結(jié)論61-62
• 參考文獻62-65
• 攻讀學位期間發(fā)表的學術(shù)論文目錄65-66
• 致謝66-67

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前9條

1 谷淑燕,趙文平,曾毅,唐慰平,趙明倫,鄧惠華,李昆;從低分化鼻咽癌病人建立鼻咽癌上皮細胞株[J];癌癥;1983年02期

2 ;Role of Epstein-Barr Virus Encoded Latent Membrane Protein 1 in the Carcinogenesis of Nasopharyngeal Carcinoma[J];Cellular & Molecular Immunology;2007年03期

3 張志偉;賀智敏;周敏;丁渭;余艷輝;陳主初;;EBV-LMP1促CNE2細胞遷移的作用機制[J];中南大學學報(醫(yī)學版);2006年04期

4 李桂源;劉華英;周鳴;周后德;李小玲;;鼻咽癌癌變的分子機理[J];生物化學與生物物理進展;2006年10期

5 唐微;朱建思;;EB病毒LMP1在腫瘤研究中的進展[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學進展;2012年07期

6 唐澤立;蘇維勇;陳小毅;陳燕;謝玲;;綠色熒光蛋白報道基因轉(zhuǎn)染鼻咽癌細胞系CNE1后的表達:用做轉(zhuǎn)染報道基因的可行性鑒定[J];中國組織工程研究與臨床康復;2008年28期

7 宗永生,吳秋良,林素暇,何潔華,張昌卿;EB病毒相關(guān)性疾病病理學研究的進展[J];中山大學學報(醫(yī)學科學版);2005年05期

8 溫見翔;余振東;吳波;黃達娜;;人鼻咽癌CNE-2細胞轉(zhuǎn)染方法的比較研究[J];中國實驗診斷學;2009年09期

9 齊巖;黃波;司晉源;張名霞;張秋航;;Rac1和Cdc42在鼻咽癌組織中的表達及預后相關(guān)性研究[J];中國實驗診斷學;2013年09期

本文編號：987315