本文關(guān)鍵詞：DFNA5生物學(xué)功能和致聾機制初探

  更多相關(guān)文章： DFNA5 細(xì)胞凋亡 耳聾

【摘要】：在所有己被克隆的耳聾基因中,DFNA5(Deafness, Autosomal Dominant Nonsyndromic Sensorineural5)是為數(shù)不多的目前為止其生物學(xué)功能及致聾機制仍不清楚的基因之一。1995年DFNA5被定位于7號染色體15區(qū)7p15,是第五個被定位的常染色體顯性遺傳性耳聾位點。1998年DFNA5基因被克隆,突變位點也被找到。到目前為止,已有多個DFNA5基因的突變被發(fā)現(xiàn)能夠引起耳聾,盡管這些位點在基因組水平都不一樣,但所有引起耳聾的DFNA5基因突變都在mRNA水平使第8外顯子漏讀從而造成開放閱讀框移框,在繼續(xù)翻譯41個本來并不存在的氨基酸后提前終止 現(xiàn)在一般認(rèn)為引起耳聾的DFNA5基因突變是一個功能獲得性(gain of function)突變,可能與第8外顯子漏讀引起的錯誤翻譯的41個氨基酸有關(guān),理由如下：1)引起耳聾的DFNA5突變都是顯性突變；2)耳聾相關(guān)的突變型DFNA5轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞能夠引起細(xì)胞死亡的增加,轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞則引起細(xì)胞周期停滯；3)DFNA5基因第5外顯子的一個突變也造成開放閱讀框提前終止,但并不引起耳聾。為了在小鼠中模擬人DFNA5耳聾突變,Van Laer L及同事利用同源重組敲除小鼠DFNA5第8外顯子,造成開放閱讀框移框從而在繼續(xù)翻譯43個原本不存在的氨基酸后提前終止翻譯(小鼠DFNA5突變錯誤翻譯的43個氨基酸與人DFNA5耳聾突變錯誤翻譯的41個氨基酸沒有同源性)。ABR檢測結(jié)果顯示該小鼠并沒有耳聾表型。這也提示我們?nèi)薉FNA5基因第8外顯子漏讀引起的錯誤翻譯的41個氨基酸可能對耳聾的發(fā)生很重要。 本論文在細(xì)胞水平對DFNA5蛋白的生物學(xué)功能進(jìn)行研究,并對DFNA5突變的致聾機制進(jìn)行初步探討。本文第一部分主要對DFNA5生物學(xué)功能進(jìn)行了研究。我們利用分子克隆方法構(gòu)建了細(xì)胞轉(zhuǎn)染、酵母雙雜交、GST-pull down等表達(dá)載體。DFNA5在COS7細(xì)胞的亞細(xì)胞定位表明,野生型DFNA5定位在細(xì)胞質(zhì)中,但是將引起耳聾的DFNA5突變型轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中后,貼壁細(xì)胞變少,且蛋白在細(xì)胞質(zhì)中定位不均勻,聚集成團。我們用酵母雙雜交、GST-pul、IP方法試圖鑒定DFNA5相互作用蛋白。遺憾的是,由于細(xì)胞毒性及蛋白容易失活等原因,目前為止沒有得到作用蛋白。 Hermann Lage等將DFNA5穩(wěn)轉(zhuǎn)入MeWo ETO1細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染有DFNA5的細(xì)胞系與對照組相比依托泊苷敏感性降低30-35%。他們利用合成熒光探針DEVD-AFC多肽檢測caspase3活性,發(fā)現(xiàn)DFNA5急轉(zhuǎn)細(xì)胞系會使caspase3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡增加。在本文第二部分中,我們通過western blot等實驗方法進(jìn)一步檢測了DFNA5寸細(xì)胞死亡的調(diào)控。同時,我們利用高通量測序的方法,篩選DFNA5下游調(diào)控基因,以進(jìn)一步了解DFNA5突變影響細(xì)胞凋亡的機制。我們的工作為深入認(rèn)識DFNA5的生物學(xué)功能及突變致聾機制奠定了良好的基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：DFNA5 細(xì)胞凋亡 耳聾
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：Q75;R764.43
【目錄】：

• 中文摘要6-8
• ABSTRACT8-10
• ~.略詞表10-12
• 前言12-20
• 第一部分 DFNA5生物學(xué)功能的研究20-58
• 第一章 DFNA5基因的克隆,表達(dá)載體的構(gòu)建22-30
• 第二章 DFNA5的亞細(xì)胞定位30-40
• 第三章 DFNA5作用蛋白的鑒定40-58
• 第一節(jié) 酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與DFNA5相互作用的蛋白40-48
• 第二節(jié) GST-pull down方法鑒定DFNA5作用蛋白48-53
• 第三節(jié) 免疫沉淀(IP)方法鑒定DFNA5作用蛋白53-58
• 第二部分 DFNA5突變的致聾機制58-76
• 第四章 DFNA5對細(xì)胞死亡的調(diào)控60-66
• 第五章 DFNA5下游基因的鑒定66-76
• 第三部分 結(jié)論與討論76-78
• 參考文獻(xiàn)78-82
• 致謝82-83
• 學(xué)位論文評閱及答辯情況表83

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 詹顯全,陳主初,關(guān)勇軍,李萃,何春梅,梁宋平,謝錦云,陳平;雙向凝膠電泳-飛行時間質(zhì)譜法分析人肺鱗癌細(xì)胞NCI-H520蛋白質(zhì)組成分[J];癌癥;2001年06期

2 王秋菊;韓東一;郭玉芬;李慶忠;袁虎;趙亞麗;蘭蘭;關(guān)靜;徐百成;郭維維;縱亮;韓明鯤;王大勇;陳之慧;劉穹;楊偉炎;沈巖;;遺傳性耳聾資源收集保存及基因定位克隆[J];中國耳鼻咽喉頭頸外科;2006年10期

3 葉勝難;曹菊陽;段海清;于黎明;韓東一;張兆山;楊偉炎;姜泗長;;非綜合征顯性遺傳性耳聾家系致病基因排除性定位研究[J];福建中醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2008年06期

4 胡巍,肖志強,陳主初,李建玲,張鵬飛,馮雪萍,易紅,余艷輝,唐新科,劉清萍,梁宋平;鼻咽癌細(xì)胞中p53相互作用蛋白質(zhì)的分離和鑒定[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2004年07期

5 徐文琳,王春麗,張永亮,廖志勇,余利紅,孟凡偉,王新興,尹昭云,錢令嘉,張成崗;腦紅蛋白與Na~+,K~+-ATP酶β2亞基的相互作用及作用位點的鑒定[J];生物化學(xué)與生物物理學(xué)報;2003年09期

6 黃翠芬,葉棋濃;蛋白質(zhì)間相互作用技術(shù)的研究近況[J];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報;1998年01期

7 廖翔,應(yīng)天翼,王恒j,王杰,魏開華,黃留玉,黃培堂;考馬斯亮藍(lán)染色雙向電泳凝膠膠內(nèi)酶切方法的改進(jìn)[J];生物技術(shù)通訊;2003年06期

8 王孝平;邢樹禮;;考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白含量的研究[J];天津化工;2009年03期

9 胡岢;老年性耳聾的研究進(jìn)展[J];中國聽力語言康復(fù)科學(xué)雜志;2005年02期

10 賈成禹,莫衛(wèi)平;蛋白電泳的高靈敏度銀染法[J];生物學(xué)雜志;1986年03期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 袁虎;非綜合征型遺傳性聽力損失家系致病基因定位克隆研究[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院;2006年

2 劉穹;非綜合征型遺傳性聽力損失家系致病基因定位克隆研究[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院;2009年

，

本文編號：774004