本文關鍵詞：外顯子組測序鑒定一個新的高度近視致病基因P4HA2

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【摘要】：背景：近視(Myopia)是一種眼睛屈光不正的狀態(tài),主要的特征為平行光線在黃斑中心凹的前面聚焦造成的視力模糊。近視可伴隨有眼底萎縮變性、視網(wǎng)膜脫落、黃斑出血,嚴重時甚至可至失明,是嚴重影響患者視力健康乃至生存質(zhì)量的一種重要疾病,在致盲眼病中居第6位。 目前已在多個不同民族和地區(qū)完成高度近視的全基因組掃描和遺傳連鎖分析。已經(jīng)定位的位點包括：1p36,2q37.1,3q26,4q12等。報道的相關致病基因包括：SCO2, LEPREL1, ZNF644,SLC39A5等。 目的：鑒定高度近視的致病基因。 方法：本研究所招募的高度近視家系(HM-SR3-2)由中南大學醫(yī)學遺傳學國家重點實驗室采集,患者均來自株洲。研究對象納入標準為近視6000(-6.00OD)以上。該高度近視家系患者由中南大學湘雅二醫(yī)院眼科兩名主治以上�？漆t(yī)生共同診斷。該家系呈現(xiàn)典型的常染色體顯性遺傳趨勢,患者表現(xiàn)為高度近視且進行性加重。高度近視185例散發(fā)病人均由湘雅二醫(yī)院眼科收集,符合納入標準。我們在HM家系中選取兩個患者和一個正常人,應用外顯子組測序的方法分析他們所有外顯子序列。然后我們運用Sanger測序法在此家系中分別驗證外顯子組測序的結果。運用Sanger測序法在散發(fā)病人中進行測序驗證。利用QPCR方法檢測病人淋巴細胞中mRNA表達。利用免疫印跡方法檢測病人淋巴細胞中蛋白水平變化。 結果：根據(jù)外顯子組測序結果,我們發(fā)現(xiàn)P4HA2基因c.871GA雜合突變在家系中與疾病共分離,且此突變位點未在209例正常人中發(fā)現(xiàn)。在185例散發(fā)患者中,發(fā)現(xiàn)P4HA2基因c.448AG, c.419AG, c.1349-1350delGT,c.1327AT雜合突變,且在300例正常人中未發(fā)現(xiàn)。QPCR結果提示,患者淋巴細胞中P4HA2mRNA表達量低于正常人,且在加入吐根堿之后達到正常人表達水平。Western blot的結果顯示,患者P4HA2蛋白表達量降低。 結論：該家系中患者均帶有P4HA2的c.871GA突變,該突變導致蛋白質(zhì)發(fā)現(xiàn)p.291EK的改變,209例正常人無此突變；散發(fā)病人中發(fā)現(xiàn)P4HA2基因c.448AG, c.419A, c.1349-1350delGT, c.1327AT雜合突變,且在300例正常人中未發(fā)現(xiàn)；家系患者P4HA2mRNA發(fā)生提前降解,患者中由P4HA2編碼的蛋白4-脯氨酰羥化酶α亞基Ⅱ表達量降低；P4HA2基因可能是此高度近視家系的致病基因。
【關鍵詞】：高度近視 外顯子組測序 P4HA2
【學位授予單位】：中南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R778.11
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-9
• 英文縮略詞表9-10
• 實驗儀器與耗材10-16
• 實驗用細胞與DNA模板16-17
• 前言17-21
• 第一章 實驗對象21-23
• 第二章 實驗方法23-33
• 2.1 外周血DNA提取23
• 2.2 外顯子組測序23-25
• 2.3 PCR引物設計25-27
• 2.4 PCR反應體系與條件27-28
• 2.5 淋巴細胞總RNA提取(使用Thermo GeneJET RNA Purification Kit)28
• 2.6 吐根堿(Emetine)處理淋巴細胞提取總RNA28-29
• 2.7 mRNA逆轉(zhuǎn)錄PCR29
• 2.8 實時熒光定量PCR29-31
• 2.9 免疫印跡31-33
• 第三章 結果33-41
• 3.1 高度近視家系HM-SR-3外顯子組測序及驗證33-36
• 3.2 P4HA2基因突變檢測36-37
• 3.3 突變蛋白預測37-38
• 3.4 患者淋巴細胞株P4HA2表達水平38-40
• 3.5 患者淋巴細胞株P4HB表達水平40-41
• 第四章 分析與討論41-44
• 第五章 結論44-45
• 參考文獻45-50
• 綜述50-68
• 參考文獻58-68
• 致謝68-69
• 個人簡歷69

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本文編號：742210