本文關鍵詞：CDK4基因在鼻咽癌中的功能和分子機制的初步研究

  更多相關文章： CDK4 鼻咽癌 miRNA 細胞周期

【摘要】：研究背景與目的鼻咽癌是中國南方和東南亞地區(qū)最常見的惡性腫瘤之一,具有明顯的區(qū)域 分布特征。在臨床上,鼻咽癌是具有特殊流行病學、臨床特點、病理組織學特 點的頭頸部惡性腫瘤。鼻咽癌的發(fā)生可能與基因易感性、環(huán)境危險因素、特定 飲食習慣和EB病毒感染及突變等因素有關。鼻咽癌的生成涉及多個基因和多 條信號通路改變,如Akt、細胞周期、Wnt通路及表皮生長因子受體信號通路等, 這些都促進了鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展。因此,鼻咽癌相關重要基因及其介導的信號 通路研究將有助于進一步揭示鼻咽癌的發(fā)病機理。我課題組主要參與利用多組含8000個基因的microarray比較了鼻咽癌組織 (鼻咽癌細胞含量占整個組織的70%以上)、混合的鼻咽癌細胞與鼻咽上皮組 織之間的基因表達譜。通過BRB軟件分析,一共獲得了435個上調基因和257 個下調基因。進一步,我們對這些差異表達基因在KEGG數(shù)據(jù)庫進行了分析, 觀察到了細胞周期信號通路在鼻咽癌中出現(xiàn)了明顯的異常,這其中就涉及了細 胞周期依賴性激酶4(CDK4)的表達異常。CDK4是絲氨酸／蘇氨酸激酶家族的成員,主要在腫瘤細胞核中表達,但并 非是一個轉錄因子。其常與周期蛋白D(cyclin D)結合形成復合物,通過調控RB 基因磷酸化水平的丟失,上調轉錄因子E2F1基因表達,從而參與細胞周期G1 向S期轉化的調節(jié),并導致腫瘤的發(fā)生。已有研究表明,相比于瘤基因CCND1, CDK4基因在小鼠惡性皮膚瘤發(fā)病過程中展示了更高的致瘤活性。此外,CDK4已經(jīng)顯示在多種腫瘤中高表達,這其中就包括了口腔鱗狀細胞、胰腺癌和肺癌等。而在鼻咽癌中,我們也發(fā)現(xiàn)了CDK4異常的高表達。以上研究提示了CDK4在起始腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要的作用。 microRNA (miRNA)是近年來發(fā)現(xiàn)生物體內源性的,長度約為20-23個核苷酸的非編碼小RNA,能通過與靶mRNA的互補配對而在轉錄后水平上對基因的表達進行負調控,導致mRNA的降解或翻譯抑制。很多證據(jù)直接表明,miRNA通過調控靶標基因的表達,參與腫瘤細胞的游走、侵襲和轉移過程。如：過表達的MicroRNA-21能直接靶擊下調MARCKS、PDCD4和PTEN蛋白表達從而影響前列腺癌、人膠質瘤、大腸癌和肝癌的游走、侵襲和轉移。過表達的miR-182通過直接抑制小眼畸形相關轉錄因子M和FOXO3蛋白表達促進黑色素瘤細胞的游走和存活。CDK4在鼻咽癌中調控哪些miRNA表達?這些miRNA是對鼻咽癌細胞的生物學行為有何影響呢?而這些miRNA又在鼻咽癌中是否反過來調控CDK4介導的細胞周期信號通路?這些都是值得我們深入研究的問題。 基于CDK4在鼻咽癌中的研究現(xiàn)狀,本課題的研究目的為明確CDK4基因在鼻咽癌中的功能,探討其與miRNA的關系及參與的信號轉導通路,為鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的分子機制研究提供新思路。 研究內容與方法 1.CDK4基因在鼻咽癌組織和細胞中的表達水平檢測：包括免疫組化和熒光定量PCR檢測CDK4表達水平。 2.沉默CDK4基因對鼻咽癌細胞生物學行為的影響及機制研究 (1)構建靶向抑制CDK4的shRNA慢病毒干擾載體,利用MTT法、Transwell小室遷移實驗及流式細胞儀檢測細胞周期等觀察CDK4表達抑制后細胞生長、遷移能力、細胞周期的變化,進一步確定CDK4基因在鼻咽癌細胞中的功能。 (2)Western blot檢測細胞周期相關基因CDK6、CCND1、P21及E2F1的表達。 3.干擾CDK4后進行miRNA芯片表達譜分析及目標miRNA的功能、機制驗證 (1)應用miRNAs表達譜芯片篩選干擾CDK4后差異表達miRNA,熒光定量PCR進一步驗證這些miRNA。 (2)選取表達差異顯著的Let-7c做為下一步研究對象, 使用Let-7c mimics/inhibitor轉染細胞后,利用MTT法、Transwell小室遷移實驗及Boyden小室侵襲實驗等觀察Let-7c mimics/inhibitor在細胞生長、遷移及侵襲能力的變化,進一步確定Let-7c在鼻咽癌細胞中的功能。 (3)利用siRNA靶向沉默E2F1,熒光定量PCR檢測Let-7c表達變化。 (4) western blot檢測Let-7c mimics/inhibitor轉染細胞后CDK4、CCND1、P15、 P16、P21及E2F1、c-myc表達的變化。 結果 1. CDK4基因在鼻咽癌組織和細胞中的表達水平檢測 免疫組化結果顯示,CDK4在大部分鼻咽上皮組織中呈低表達在鼻咽癌組織中有不同程度的表達,但以高表達為主,差異有統(tǒng)計學意義(x2=10.997,P0.001)。選取8例鼻咽癌組織和8例鼻咽上皮組織進一步用熒光定量PCR驗證CDK4表達情況,CDK4在鼻咽癌組織中的表達高于鼻咽上皮組織,結果顯示差異具有統(tǒng)計學意義(t=-3.483,P=0.003)。熒光定量PCR顯示,CDK4在8種鼻咽癌細胞SUNE1、5-8F、6-10B、CNE2、CNE1、HNE1、C6661、HONE1中mRNA水平表達較高,差異有統(tǒng)計學意義(F=26.745,P0.001),其中5-8F和6-10B表達最高,可作為下一步實驗對象。 2.沉默CDK4基因對鼻咽癌細胞生物學行為的影響 建立慢病毒干擾載體和陰性對照載體,包裝慢病毒后感染5-8F細胞,由于感染效率達到90%以上,western blot檢測干擾后CDK4蛋白的表達明顯下降,可直接用于后續(xù)實驗。陽性干擾多克隆命名為C1-6、D2-4,陰性對照多克隆為MOCK。 1)MTT法檢測細胞增殖情況,與空載對照細胞MOCK相比,干擾多克隆細胞C1-6、D2-4生長速度明顯減慢,差異有統(tǒng)計學意義(F=38.163P0.001)。 2)Transwell小室遷移實驗,細胞培養(yǎng)12h后C1-6、D2-4穿過聚碳酸酯膜的數(shù)量多于MOCK(F=38.629,P0.001)。提示干擾CDK4后,細胞運動能力減弱。 3)流式細胞儀檢測細胞周期,C1-6、D2-4,與空載細胞相比,前者在G1期比例增高,差異有統(tǒng)計學意義(F=6.163,P=0.027),提示CDK4表達抑制組明顯出現(xiàn)了細胞由G1向S期的轉化障礙,細胞阻滯在G1期。 4)采用western blot檢測了干擾CDK4后細胞周期相關基因CDK6、CCND1、P21及E2F1的表達,結果顯示CCND1、CDK6、E2F1表達下調,P21表達上調。 3.干擾CDK4后miRNA芯片表達譜分析及功能、機制驗證 1)干擾CDK4后的miRNA表達譜芯片研究,并利用BRB軟件分析,最后共得到35個差異的miRNAs基因,差異的倍數(shù)變動在1.95-19.25之間不等,而且這35個miRNAs基因都展示一致上調。熒光定量PCR顯示,Let-7c表達差異顯著,選取Let-7c做為下一步研究對象。 2)靶向沉默E2F1后Let-7c的表達明顯上調(5-8G：t=-36.565,P0.001；6-10B：t=-34.738,P0.001)。 3)使用Let-7c mimics/inhibitor轉染細胞后,MTT法檢測細胞增殖情況,與空載對照細胞mimics Ctr/inhibitor Ctr相比,Let-7c mimics組細胞生長速度明顯減慢,Let-7c inhibitor組細胞生長速度明顯加快,差異有統(tǒng)計學意義(Mimics F=25.486, P=0.021, Inhibitor F=43.894,P0.001)。 4)Transwell小室遷移實驗,細胞培養(yǎng)12h后以,對照組相比,L--7c mimics組細胞穿過聚碳酸酯膜的數(shù)量減少,Let-7c inhibitor組細胞穿過聚碳酸酯膜的數(shù)量增加,差異有統(tǒng)計學意義(Mimics t=7.572,P0.001,Inhibitort=5.494,P0.001)。提示過表達Let-7c后,細胞遷移能力減弱,干擾Let-7c后,細胞遷移能力增強。 5)Boyden小室侵襲實驗,細胞培養(yǎng)12h后以,對照組相比,Let-7c mimics組細胞穿過聚碳酸酯膜的數(shù)量減少,Let-7c inhibitor組細胞穿過聚碳酸酯膜的數(shù)量增加,差異有統(tǒng)計學意義(Mimics t=6.147, P＜0.001, Inhibitort=5.741,P0.001)。提示過表達Let-7c后,細胞侵襲能力減弱,干擾Let-7c表達后,細胞侵襲能力增強。 6)采用western blot檢測Let-7c mimics/inhibitor轉染細胞后細胞周期基因CDK4、P15、P16、P21、及E2F1、c-myc表達的變化,結果顯示Let-7c mimics轉染細胞后,CDK4、E2F1、c-myc表達下調,P15、P16、P21表達上調,反之亦然。 結論 1.干擾CDK4后,鼻咽癌細胞的增殖、運動能力顯著降低,提示CDK4在鼻咽癌中是一個腫瘤促進相關基因。 2.干擾CDK4后可能抑制細胞周期信號通路,通過抑制CCND1、CDK6及上調P21的表達參與細胞周期的調控；CDK4通過轉錄因子E2F1調節(jié)Let-7c的表達。 3.過表達Let-7c后,鼻咽癌細胞的增殖、遷移、侵襲能力顯著降低,提示Let-7c在鼻咽癌中發(fā)揮了抑瘤的功能。其可能通過p15/p16/CDK4/E2F1信號通路發(fā)揮其抑瘤功能。
【關鍵詞】：CDK4 鼻咽癌 miRNA 細胞周期
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R739.63
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-15
• 前言15-20
• 技術路線20-21
• 第一章 CDK4在鼻咽癌組織及細胞中的表達特性鑒定21-31
• 一 材料與方法21-25
• 二 結果25-29
• 三 討論29-30
• 參考文獻30-31
• 第二章 沉默CDK4對鼻咽癌細胞生物學行為的影響31-43
• 一 材料和方法31-36
• 二 結果36-41
• 三 討論41-43
• 第三章 沉默CDK4基因后miRNA芯片表達譜分析及目標miRNA的功能驗證43-64
• 一 材料和方法43-52
• 二 結果52-59
• 三 討論59-61
• 參考文獻61-64
• 全文小結64-66
• 中英文縮略詞66-67
• 致謝67-68

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 李杰恩,周永,藍新海,譚頌華,唐安洲,王仁生,馮震博;鼻咽癌組織放療前后細胞增殖凋亡的變化[J];腫瘤;2001年05期

2 汪波,石靈春,譚敏,肖楚梅,周丹;細胞周期調控基因在鼻咽癌發(fā)生中的表達[J];解剖學研究;2001年03期

3 陳淑勤,黃培生,李一偉,高凌云,王鏞;尿激酶型纖溶酶原激活物在鼻咽癌的表達及臨床意義[J];福建醫(yī)科大學學報;2002年01期

4 郜紅藝,吳秋良,張玉;鼻咽癌預后相關的病理學研究[J];廣東醫(yī)學;2002年04期

5 周小軍 ,田道法;鼻咽癌高危人群病理特征研究進展[J];廣西醫(yī)學;2002年05期

6 陳斌,殷善開;鼻咽癌的病因和流行病學狀況[J];中國全科醫(yī)學;2002年04期

7 賀智敏,王水良,袁建輝,陳主初;人細胞色素P450 2E1基因在胚胎鼻咽組織、鼻咽癌細胞和組織中的表達[J];癌癥;2002年06期

8 張明,劉立思,程磊;熱休克蛋白60表達和一氧化氮在鼻咽癌中的意義[J];華中科技大學學報(醫(yī)學版);2003年06期

9 王茂鑫;;鼻咽癌組織中凋亡相關基因蛋白表達及其意義[J];福州總醫(yī)院學報;2004年04期

10 黃文君,賴祥進;鼻咽癌相關候選基因的研究[J];實用癌癥雜志;2005年02期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 符生苗;梁茱;董玉英;;鼻咽癌的P_(16)基因表達分析[A];面向21世紀的科技進步與社會經(jīng)濟發(fā)展（下冊）[C];1999年

2 劉青;王雅棣;景尚華;王曉玲;程云杰;吳鳳鵬;;E-鈣粘蛋白在鼻咽癌組織中的表達水平與頸部淋巴結轉移的關系[A];中華醫(yī)學會放射腫瘤治療學分會六屆二次暨中國抗癌協(xié)會腫瘤放療專業(yè)委員會二屆二次學術會議論文集[C];2009年

3 邵建永;王海云;朱志華;孫炳宇;陳靜;杜子明;張家興;邵瓊;黃馬燕;符珈;廖定準;侯景輝;盧泰祥;葉偉民;Ingemar Ernberg;曾益新;;鼻咽癌分子分型研究[A];中華醫(yī)學會病理學分會2010年學術年會日程及論文匯編[C];2010年

4 王樹森;管忠震;向燕群;汪波;林桐榆;姜文奇;張力;張惠忠;侯景輝;;鼻咽癌組織中EGFR信號傳導通路相關分子的表達[A];第三屆中國腫瘤學術大會教育論文集[C];2004年

5 陳顯釗;;鼻咽癌診治研究進展[A];海南省第二屆腫瘤學術會議論文集[C];2005年

6 林少民;唐啟信;;鼻咽癌家族腫瘤史115例調查分析[A];海南省第二屆腫瘤學術會議論文集[C];2005年

7 邵世宏;姚運紅;;鼻咽癌腫瘤干細胞及其表面標志物初步研究[A];中華醫(yī)學會病理學分會2006年學術年會論文匯編[C];2006年

8 李菊蘭;蔡華成;梁傳余;韓偉;;生長抑素Ⅱ型受體在鼻咽癌組織中的表達[A];中華醫(yī)學會第十次全國耳鼻咽喉-頭頸外科學術會議論文匯編（下）[C];2007年

9 項光早;;微血管密度與鼻咽癌生長、浸潤、轉移和預后關系的研究[A];浙江省醫(yī)學會耳鼻咽喉科學分會成立60周年慶典暨2011年浙江省醫(yī)學會耳鼻咽喉頭頸外科學學術年會論文匯編[C];2011年

10 潘建基;;鼻咽癌臨床診治現(xiàn)狀和進展[A];中國腫瘤內科進展 中國腫瘤醫(yī)師教育（2014）[C];2014年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前6條

1 湯清波邋李奇 劉齡予;挑戰(zhàn)“鼻咽癌”的人[N];大眾衛(wèi)生報;2007年

2 本報記者　 盧育輝;崇尚“紅�！本�,喜歡“咖啡”會友[N];廣東科技報;2006年

3 本報記者　 羅艾樺;挑戰(zhàn)“廣東癌”[N];人民日報;2006年

4 仁華南;“回國發(fā)展是一項明智的選擇”[N];人民日報海外版;2006年

5 本報記者 謝明霞;從蛋白質組學入手 探究鼻咽癌[N];健康報;2011年

6 廣東省第二人民醫(yī)院 主任醫(yī)師 蔡長青;病毒與某些癌癥[N];家庭醫(yī)生報;2005年

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 周文;鼻咽癌染色體12p12-11區(qū)段擴增基因的篩選及其功能研究[D];中南大學;2010年

2 覃綱;免疫球蛋白M與鼻咽癌的實驗研究[D];四川大學;2007年

3 鄭英;基于鼻咽癌潛在靶標的活體光學成像與靶向治療研究[D];華中科技大學;2012年

4 鄧鵬;鐵皮石斛抗鼻咽癌的作用研究[D];廣西醫(yī)科大學;2010年

5 俞艷萍;ABCG2在鼻咽癌中的表達及其在鼻咽癌化療中的作用[D];華中科技大學;2010年

6 陳舒華;鼻咽癌高癌家系體質證型的蛋白質組學研究[D];湖南中醫(yī)藥大學;2008年

7 何英;7個鼻咽癌相關基因單核苷酸多態(tài)性的篩查及其與鼻咽癌易感性的關聯(lián)分析[D];中國人民解放軍第一軍醫(yī)大學;2003年

8 王路;EBNA1在鼻咽癌轉移中的作用及分子機制研究[D];南方醫(yī)科大學;2011年

9 樓建軍;抑癌基因單核苷酸多態(tài)性與鼻咽癌遺傳易感性研究[D];廣西醫(yī)科大學;2012年

10 張e，

本文編號：660716