目的:探討在角膜中期保存過程中角膜內(nèi)皮細胞發(fā)生自噬的作用及內(nèi)在機制。方法:用Optisol保存大鼠角膜,建立角膜中期保存的模型。茜素紅染色觀察角膜內(nèi)皮細胞數(shù)目、形態(tài),免疫熒光染色檢測內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)及功能相關(guān)標志物ZO-1、F-actin、N-cadherin及Na+-K+-ATPase的表達變化,掃描電鏡觀察內(nèi)皮細胞超微結(jié)構(gòu)的改變;蛋白質(zhì)印跡和免疫熒光染色檢測自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin 1、SQSTM1/P62表達的改變;TUNEL染色和免疫熒光染色檢測活化的caspase3觀察細胞凋亡的情況;我們還進行了大鼠的角膜移植,并研究了自噬激動劑或抑制劑(雷帕霉素或氯喹)的作用。結(jié)果:在角膜保存過程中,隨時間延長,角膜內(nèi)皮細胞數(shù)量逐漸減少,出現(xiàn)形態(tài)改變,細胞核皺縮,細胞連接ZO-1不完整、細胞骨架F-actin、細胞表面黏附分子N-cadherin破壞,Na+-K+-ATPase異常表達。掃描電鏡顯示角膜內(nèi)皮細胞間連接斷裂,細胞水腫,表面微絨毛消失。同時,免疫熒光和免疫印跡等檢測方法顯示LC3Ⅱ及Beclin1的表達隨時間延長先增后減,15d達峰值;SQSTM1/P62變化趨勢與之相反。...

【文章頁數(shù)】：70 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 前言
    1.1 角膜內(nèi)皮細胞
        1.1.1 角膜內(nèi)皮細胞的形態(tài)特征
        1.1.2 角膜內(nèi)皮細胞的功能
    1.2 角膜保存
        1.2.1 角膜保存的發(fā)展
        1.2.2 角膜保存的方法
        1.2.3 角膜保存的展望
    1.3 自噬
        1.3.1 自噬概述
        1.3.2 自噬的研究方法
        1.3.3 自噬的雙重作用
    1.4 角膜疾病中的自噬
        1.4.1 角膜內(nèi)皮營養(yǎng)不良
        1.4.2 角膜相關(guān)微生物感染
        1.4.3 圓錐角膜
        1.4.4 Schnyder角膜營養(yǎng)不良(SCD)
第二章 實驗材料
    2.1 實驗動物
    2.2 主要抗體
    2.3 主要實驗試劑及耗材
    2.4 主要試驗儀器
    2.5 主要試驗溶液的配制
        2.5.1 Whole mount免疫熒光染色相關(guān)試劑的配制
        2.5.2 茜素紅染色相關(guān)試劑的配制
        2.5.3 Western blot相關(guān)溶液配制
        2.5.4 TUNEL染色相關(guān)試劑的配制
        2.5.5 掃描電子顯微鏡相關(guān)試劑的配制
        2.5.6 自噬抑制劑、激活劑等相關(guān)溶液的配制
    2.6. 主要應(yīng)用軟件
第三章 實驗方法
    3.1 相關(guān)模型的建立與觀察
        3.1.1 大鼠角膜保存模型的建立
        3.1.2 保存后的觀察
        3.1.3 大鼠角膜移植模型的建立
    3.2 茜素紅染色
    3.3 全角膜片Whole mount免疫熒光染色
    3.4 掃描電鏡
        3.4.1 取材和固定
        3.4.2 脫水
        3.4.3 冷凍干燥與噴金
        3.4.4 掃描電鏡觀察
    3.5 TUNEL染色
        3.5.1 全角膜片的TUNEL染色
    3.6 Western blot免疫印跡分析
        3.6.1 組織蛋白的提取
        3.6.2 蛋白樣品的定置與制備
        3.6.3 SDS-PAGE凝膠的制備
        3.6.4 SDS-PAGE電泳
        3.6.5 轉(zhuǎn)膜
        3.6.6 免疫反應(yīng)與顯影
    3.7 統(tǒng)計學(xué)分析
第四章 結(jié)果
    4.1 角膜保存過程中內(nèi)皮細胞的改變
        4.1.1 角膜保存過程中內(nèi)皮細胞數(shù)量、形態(tài)及功能的改變
        4.1.2 角膜保存過程中內(nèi)皮細胞超微結(jié)構(gòu)的改變
    4.2 角膜保存過程中內(nèi)皮細胞的自噬
    4.3 角膜保存過程中內(nèi)皮細胞的凋亡
    4.4 自噬調(diào)控劑對角膜保存中內(nèi)皮細胞的影響
        4.4.1 自噬調(diào)控劑調(diào)節(jié)角膜保存中內(nèi)皮細胞的自噬
        4.4.2 自噬對角膜保存中內(nèi)皮細胞的凋亡的影響
        4.4.3 自噬對角膜保存中內(nèi)皮細胞的活性的影響
        4.4.4 大鼠角膜移植后的角膜狀態(tài)
第五章 討論
    5.1 角膜保存過程可誘導(dǎo)角膜內(nèi)皮細胞發(fā)生自噬
    5.2 自噬對角膜內(nèi)皮細胞的保護作用
    5.3 自噬在角膜內(nèi)皮疾病中的潛在應(yīng)用價值
第六章 結(jié)論
附錄 中英文對照表
參考文獻
致謝



本文編號：3816443