本文關(guān)鍵詞：腫瘤抑素對(duì)恒河猴脈絡(luò)膜—視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞生長影響的實(shí)驗(yàn)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景流行病學(xué)研究表明,隨著感染性眼病控制,新生血管性眼病已成為發(fā)達(dá)國家失明的重要原因,而視網(wǎng)膜新生血管(retinal neovascularization, RNV)性疾病是目前主要的致盲眼病,但目前的治療效果均不理想。新生血管的生成是血管內(nèi)皮細(xì)胞不斷分裂增殖和遷移的復(fù)雜過程,目前用于治療研究的藥物主要有血管生成因子表達(dá)的抑制劑如抗VEGF抗體和內(nèi)源性血管生成抑制因子如內(nèi)皮抑素(Endostatin, ES)等,腫瘤抑素是迄今發(fā)現(xiàn)活性最強(qiáng)的內(nèi)源性血管生成抑制因子,對(duì)病理性新生血管生成有明顯抑制作用。 目的構(gòu)建及鑒定經(jīng)信號(hào)肽優(yōu)化后帶有HA-tag標(biāo)記的攜帶人腫瘤抑素(Tumstatin)活性片段Tum-5基因真核表達(dá)載體并研究抗腫瘤血管生成抑制基因Tum-5對(duì)恒河猴脈絡(luò)膜-視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞(rhesus choroidoretinal endothelial cell, RF/6A)生長的影響。 方法本研究包括兩部分：1.設(shè)計(jì)并構(gòu)建經(jīng)信號(hào)肽優(yōu)化后帶有HA-tag標(biāo)記的攜帶Tum5重組基因真核表達(dá)載體PCMV-Tum5-MCS,通過酶切、測(cè)序驗(yàn)證Tum5基因構(gòu)建情況；2.利用脂質(zhì)體Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染系統(tǒng)將PCMV-Tum5-MCS質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染入體外培養(yǎng)的RF/6A細(xì)胞(轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)組),同時(shí)設(shè)置空質(zhì)粒載體陰性對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染組；采用Dot blot方法用HA抗體檢測(cè)細(xì)胞上清液中Tum5蛋白的表達(dá)水平；通過MTT法檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24h、48h和72h三個(gè)不同時(shí)相點(diǎn)細(xì)胞增殖抑制率；利用體外細(xì)胞劃痕試驗(yàn),分別考察在0h、24h、48h三個(gè)不同時(shí)相點(diǎn),Tumm5與RF/6A遷移與侵襲的關(guān)系；運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)比較三組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后細(xì)胞周期情況。 結(jié)果1.經(jīng)過酶切,測(cè)序鑒定PCMV-Tum5-MCS真核表達(dá)載體構(gòu)建成功；2.瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Tumm-5載體構(gòu)建成功；3.Dot blot法檢測(cè)出Tum5基因在RF/6A細(xì)胞上清中蛋白表達(dá)成陽性；4.轉(zhuǎn)染后24h、48h和72h,轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖抑制率均明顯高于空白對(duì)照組和空質(zhì)粒陰性對(duì)照組(P0.05),其中各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染72h后增殖抑制率均高于48h、24h(P0.05)；5.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Tum5基因?qū)F/6A細(xì)胞的遷移率較空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組明顯下降(P0.05)；6.流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示：正常細(xì)胞組G1期72.32%G2期7.22%S期20.46%,空質(zhì)粒載體陰性對(duì)照組G1期75.92%G2期3.23%S期20.84%PCMV-Tum5-MCS質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染組G1期65.21%G2期4.79%S期30.00%,PCMV-Tum5-MCS質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染組G1期比例下降,S期比例顯著上升,正常細(xì)胞組和空質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染組沒有明顯差異。 結(jié)論成功構(gòu)建了攜帶Tum5基因的真核表達(dá)載體,體外轉(zhuǎn)染RF/6A后能夠穩(wěn)定表達(dá)Tum5基因,具有抑制RF/6A增殖,移行的功能,使細(xì)胞周期阻滯于S期。為進(jìn)一步研究Tum5的功能和眼部新生血管疾病的治療奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：視網(wǎng)膜新生血管 腫瘤抑素 血管生成 眼科 增殖
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R774.1
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• ~.略語/符號(hào)說明10-11
• 前言11-13
• 研究現(xiàn)狀、成果11-12
• 研究目的、方法12-13
• 一、經(jīng)信號(hào)肽優(yōu)化后攜帶人腫瘤抑素(tumstatin)活性片段Tum-5基因的真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定13-29
• 1.1 材料和方法13-20
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料13-14
• 1.1.2 經(jīng)信號(hào)肽優(yōu)化后攜帶人腫瘤抑素(tumstatin)活性片段Tum-5基因重組質(zhì)粒PCMV-Tum5-MCS的構(gòu)建14-19
• 1.1.3 重組質(zhì)粒PCMV-Tum5-MCS的鑒定19-20
• 1.2 結(jié)果20-26
• 1.2.1 質(zhì)粒圖譜20-21
• 1.2.2 目的基因TA克隆后測(cè)序結(jié)果21
• 1.2.3 重組質(zhì)粒PCMV-Tum5-MCS的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果21-22
• 1.2.4 重組質(zhì)粒PCMV-Tum5-MCS的雙酶切鑒定22-23
• 1.2.5 重組質(zhì)粒PCMV-Tum5-MCS的測(cè)序鑒定23-26
• 1.3 討論26-28
• 1.3.1 腫瘤抑素研究進(jìn)展26-27
• 1.3.2 腫瘤抑素重組基因載體構(gòu)建27-28
• 1.4 小結(jié)28-29
• 二、Tum-5基因?qū)锩}絡(luò)膜-視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞生長的影響29-47
• 2.1 材料和方法29-38
• 2.1.1 細(xì)胞株及主要試劑29-31
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)方法31-37
• 2.1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理37-38
• 2.2 結(jié)果38-43
• 2.2.1 PCMV-Tum5-MCS轉(zhuǎn)染RF/6A細(xì)胞38
• 2.2.2 斑點(diǎn)印跡法檢測(cè)RF/6A細(xì)胞Tum5蛋白表達(dá)38-39
• 2.2.3 MTT法檢測(cè)PCMV-Tum5-MCS對(duì)RF/6A細(xì)胞增殖的影響39-40
• 2.2.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PCMV-Tum5-MCS對(duì)RF/6A細(xì)胞移行的作用效應(yīng)40-42
• 2.2.5 RF/6A轉(zhuǎn)染Tum5細(xì)胞周期檢測(cè)42-43
• 2.3 討論43-46
• 2.3.1 腫瘤抑素因子與新生血管性眼病43-45
• 2.3.2 腫瘤抑素對(duì)RF/6A細(xì)胞生長的抑制作用45-46
• 2.4 小結(jié)46-47
• 結(jié)論47-48
• 參考文獻(xiàn)48-52
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明52-53
• 綜述53-68
• 綜述參考文獻(xiàn)62-68
• 致謝68

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 孫靖;李筱榮;;靶向血管內(nèi)皮生長因子治療眼新生血管的研究進(jìn)展[J];眼科新進(jìn)展;2008年01期

2 黃敏麗;羅國容;陳維平;何少健;陳芳;;Tumstatin肽對(duì)視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞增生和遷移的影響[J];眼科新進(jìn)展;2008年09期

3 彭淑平,方唯意,蔣日成,周建國,董琳,曹建國;血管基膜衍生多功能肽在大腸桿菌中的表達(dá)及抗腫瘤活性的測(cè)定[J];中國藥理學(xué)通報(bào);2003年06期

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本文編號(hào)：318773