目的:我們?cè)谥袊?guó)東北地區(qū)收集到兩個(gè)先天性白內(nèi)障家系,家系一表現(xiàn)為先天性白內(nèi)障伴小眼,家系二表現(xiàn)為先天性核性白內(nèi)障。分別對(duì)兩個(gè)先天性白內(nèi)障家系的致病基因進(jìn)行篩查,并進(jìn)一步對(duì)可能的致病機(jī)制進(jìn)行研究。方法:采集家系成員外周血,提取基因組DNA。對(duì)于家系一,根據(jù)白內(nèi)障表型,對(duì)7個(gè)候選致病基因編碼區(qū)及側(cè)翼序列直接測(cè)序。篩查到突變位點(diǎn),通過(guò)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析在家系和人群中驗(yàn)證。將野生型（WT）CRYAA和突變型（R12L）CRYAA的pcDNA3.1（+）表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞和Hela細(xì)胞中,用Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平和蛋白溶解性,用免疫熒光檢測(cè)蛋白的亞細(xì)胞定位。對(duì)于家系二,通過(guò)Miseq測(cè)序平臺(tái)對(duì)4813個(gè)臨床疾病相關(guān)基因進(jìn)行高通量測(cè)序,篩查致病變異。對(duì)候選MAF基因突變進(jìn)行PCR擴(kuò)增并Sanger測(cè)序驗(yàn)證。基于美國(guó)遺傳醫(yī)學(xué)會(huì)指南和多種算法對(duì)候選致病位點(diǎn)致病性進(jìn)行預(yù)測(cè)。REVEL,SIFT和PolyPhen2等也被用來(lái)預(yù)測(cè)突變所導(dǎo)致的蛋白功能改變。將野生型（WT）MAF和突變型（V271E）MAF的pcDNA3.1（+）表達(dá)載體分別與pGL3-晶狀體基因啟動(dòng)... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)遼寧省

【文章頁(yè)數(shù)】：115 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略語(yǔ)
前言
第一部分：伴小眼球的先天性白內(nèi)障家系(家系一)致病基因篩查及鑒定.
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 實(shí)驗(yàn)儀器
        2.2 實(shí)驗(yàn)中常用相關(guān)試劑及配制
            2.2.1 DNA提取
            2.2.2 酶和相關(guān)試劑
            2.2.3 瓊脂糖凝膠電泳
            2.2.4 DNA聚丙烯酰胺凝膠電泳
            2.2.5 載體構(gòu)建相關(guān)
            2.2.6 細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)
            2.2.7 Western-blot相關(guān)試劑及緩沖液
            2.2.8 免疫熒光相關(guān)試劑、緩沖液
        2.3 方法
            2.3.1 家系資料
            2.3.2 突變篩查
            2.3.3 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析在家系和人群中驗(yàn)證突變
T,p.R12L突變致病性預(yù)測(cè)">            2.3.4 CRYAA基因c.35G>T,p.R12L突變致病性預(yù)測(cè)
            2.3.5 構(gòu)建野生型CRYAA表達(dá)載體
            2.3.6 突變型CRYAA載體構(gòu)建
            2.3.7 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染
            2.3.8 Westernblot檢測(cè)蛋白水平
            2.3.9 免疫熒光檢測(cè)蛋白的細(xì)胞定位
    3 研究結(jié)果
        3.1 臨床資料及表型分析
        3.2 致病基因篩查
        3.3 致病基因在家系和人群驗(yàn)證
T,p.R12L突變致病性預(yù)測(cè)">        3.4 CRYAA基因c.35G>T,p.R12L突變致病性預(yù)測(cè)
            3.4.1 ACMG和AMP指南
            3.4.2 SIFT
            3.4.3 PlolyPhen-2
            3.4.4 CRYAA基因編碼的蛋白結(jié)構(gòu)和功能
        3.5 CRYAA表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.6 WT-CRYAA與R12L-CRYAA的表達(dá)水平
        3.7 WT-CRYAA與R12L-CRYAA蛋白的亞細(xì)胞定位
    4 討論
    5 結(jié)論
第二部分：先天性核性白內(nèi)障家系(家系二)致病基因篩查及鑒定
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 實(shí)驗(yàn)儀器
        2.2 實(shí)驗(yàn)中常用相關(guān)試劑及配制
            2.2.1 DNA提取
            2.2.2 酶和相關(guān)試劑
            2.2.3 高通量測(cè)序相關(guān)試劑
            2.2.4 瓊脂糖凝膠電泳
            2.2.5 載體構(gòu)建相關(guān)
            2.2.6 細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)
            2.2.7 熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)
        2.3 方法
            2.3.1 家系資料
            2.3.2 突變篩查
            2.3.3 變異的致病性預(yù)測(cè)
            2.3.4 表達(dá)載體的構(gòu)建
            2.3.5 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染
            2.3.6 熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)
    3 研究結(jié)果
        3.1 臨床資料及表型分析
        3.2 致病基因篩查及驗(yàn)證
A,p.V217E突變致病性預(yù)測(cè)">        3.3 MAF基因c.812T>A,p.V217E突變致病性預(yù)測(cè)
            3.3.1 ACMG和AMP指南
            3.3.2 SIFT
            3.3.3 PlolyPhen-2
            3.3.4 MAF基因編碼的蛋白結(jié)構(gòu)和功能
            3.3.5 MAF基因編碼的蛋白結(jié)構(gòu)和功能
        3.4 MAF表達(dá)載體的構(gòu)建
A,p.V271E對(duì)轉(zhuǎn)錄因子活性的影響">        3.5 突變MAFc.812T>A,p.V271E對(duì)轉(zhuǎn)錄因子活性的影響
    4 討論
    5 結(jié)論
本研究創(chuàng)新性及局限性的自我評(píng)價(jià)
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間取得的科研成果
致謝
個(gè)人簡(jiǎn)介


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]一個(gè)新的GJA8突變導(dǎo)致一家系遺傳性白內(nèi)障[J]. 肖偉,張?zhí)鞎?張勁松.  眼科新進(jìn)展. 2011(04)

博士論文
[1]先天性核性白內(nèi)障家系的疾病相關(guān)候選基因定位及功能研究[D]. 王琦瑋.浙江大學(xué) 2015

碩士論文
[1]PAX6基因突變所致的先天無(wú)虹膜伴進(jìn)展性白內(nèi)障一個(gè)中國(guó)家系研究[D]. 王琦瑋.浙江大學(xué) 2012



本文編號(hào)：3172305