目的：脈絡(luò)膜、視網(wǎng)膜新生血管形成是眼底病患者視力損害的主要原因。缺氧導(dǎo)致的血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）分泌增高，促使血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移是眼底新生血管形成的共同病理特點，但目前尚缺乏安全有效的治療方法。如何抑制低氧條件下VEGF的過量分泌是治療脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜新生血管的關(guān)鍵。Decorin是一種小分子富含亮氨酸的蛋白聚糖，對細胞表面多種受體酪氨酸激酶具有拮抗作用，但能否調(diào)控眼底新生血管的形成尚不明確。本課題首先檢測decorin對人視網(wǎng)膜色素上皮細胞（ARPE-19）低氧條件下分泌VEGF的影響及可能機制；然后構(gòu)建攜載decorin編碼基因的慢病毒載體轉(zhuǎn)染ARPE-19細胞，并與脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞（RF/6A）共培養(yǎng)，檢測轉(zhuǎn)染的ARPE-19細胞低氧條件下對RF/6A細胞血管生成能力的影響；最后，構(gòu)建攜載decorin編碼基因的自身互補型腺相關(guān)病毒載體，建立小鼠氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變模型，在體觀察decorin對視網(wǎng)膜新生血管的抑制作用。方法：（1）體外實驗部分：首先應(yīng)用CCK-8和ELISA法明確decorin抑制A... 

【文章來源】：上海交通大學(xué)上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：101 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
圖題索引
縮略詞
目錄
緒論
第一章 Decorin 抑制視網(wǎng)膜色素上皮細胞低氧條件下 VEGF 分泌的研究
    1.1 前言
    1.2 材料與方法
        1.2.1 實驗材料
        1.2.2 ARPE-19 細胞培養(yǎng)和低氧模型
        1.2.3 CCK-8 檢測不同濃度 decorin 對細胞活力的影響
        1.2.4 ELISA 法檢測 decorin 抑制 ARPE-19 細胞低氧條件下分泌 VEGF 的作用
        1.2.5 熒光定量 PCR 檢測 decorin 對 ARPE-19 細胞低氧條件下 Met、Rac1、HIF-1α和VEGF mRNA表達的影響
        1.2.6 Western blot 檢測 decorin 對 ARPE-19 細胞低氧條件下 Met、Rac1 和 HIF-1α蛋白表達的影響
        1.2.7 敲除 ARPE-19 細胞的 Met 基因及驗證
        1.2.8 ARPE-19 細胞轉(zhuǎn)染 Met siRNA 后在低氧條件下 Rac1、HIF-1α和 VEGF 的表達變化
        1.2.9 統(tǒng)計學(xué)分析
    1.3 結(jié)果
        1.3.1 不同濃度 decorin 對 ARPE-19 細胞活力的影響
        1.3.2 不同濃度 decorin 對 ARPE-19 細胞低氧條件下過量分泌 VEGF 的影響
        1.3.3 Decorin 抑制 ARPE-19 細胞低氧條件下 Met、Rac1、HIF-1α和 VEGF 的高表達
        1.3.4 Met siRNA 抑制 ARPE-19 細胞低氧條件下 Met、Rac1、HIF-1α和 VEGF 的表達
    1.4 討論
第二章 視網(wǎng)膜色素上皮細胞 decorin 過表達抑制脈絡(luò)膜新生血管形成的體外研究
    2.1 前言
    2.2 材料與方法
        2.2.1 實驗材料
        2.2.2 構(gòu)建含 decorin 開框區(qū)序列的慢病毒質(zhì)粒 pGMLV-PA5
        2.2.3 慢病毒的包裝和濃縮
        2.2.4 攜 decorin 基因的慢病毒載體轉(zhuǎn)染 ARPE-19 細胞的驗證
        2.2.5 ARPE-19 細胞 decorin 過表達對低氧環(huán)境下 VEGF 分泌的影響
        2.2.6 ARPE-19 細胞與 RF/6A 細胞共培養(yǎng)
        2.2.7 統(tǒng)計學(xué)分析
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 成功構(gòu)建含 decorin 開框區(qū)的慢病毒質(zhì)粒 pGMLV-PA5
        2.3.2 ARPE-19 細胞轉(zhuǎn)染攜 decorin 基因慢病毒載體的驗證
        2.3.3 低氧環(huán)境下 ARPE-19 細胞 decorin 過表達對 VEGF 分泌的影響
        2.3.4 低氧條件下 ARPE-19 細胞過表達 decorin 抑制共培養(yǎng) RF/6A 細胞的血管生成能力
    2.4 討論
第三章 自身互補型腺相關(guān)病毒攜載 decorin 抑制 C57 小鼠視網(wǎng)膜新生血管的實驗研究
    3.1 前言
    3.2 材料與方法
        3.2.1 實驗材料
        3.2.2 原代培養(yǎng)大鼠神經(jīng)膠質(zhì)細胞
        3.2.3 構(gòu)建含 decorin 開框區(qū)序列的自身互補型腺相關(guān)病毒質(zhì)粒scAAV-CMV-decorin
        3.2.4 自身互補型腺相關(guān)病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大鼠神經(jīng)膠質(zhì)細胞的驗證及病毒包裝
        3.2.5 小鼠氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變模型建立及玻璃體腔注射
        3.2.6 視網(wǎng)膜鋪片染色
        3.2.7 熒光定量 PCR 檢測
        3.2.8 Western blot 檢測
        3.2.9 ELISA 檢測
        3.2.10 統(tǒng)計學(xué)分析
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 大鼠神經(jīng)膠質(zhì)細胞的培養(yǎng)和鑒定
        3.3.2 scAAV-CMV-Decorin 病毒質(zhì)粒的構(gòu)建及驗證
        3.3.3 scAAV-CMV-decorin 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大鼠神經(jīng)膠質(zhì)細胞的驗證
        3.3.4 玻璃體腔注射 scAAV-CMV-decorin 病毒抑制 OIR 小鼠視網(wǎng)膜新生血管的生成
        3.3.5 玻璃體腔注射 scAAV-CMV-decorin 病毒抑制 OIR 小鼠視網(wǎng)膜 HIF-1α和 VEGF的表達
    3.4 討論
結(jié)論
參考文獻
致謝
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本文編號：3000076