目的:研究接頭蛋白Crk II在喉鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá),探究Crk II蛋白與喉鱗狀細(xì)胞癌臨床病理特征的關(guān)系,并采用RNA干擾法敲低Crk II的表達(dá),研究Crk II的表達(dá)水平下調(diào)后對喉癌Hep-2細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響。方法:采用免疫組織化學(xué)法(SP法)對54例喉癌手術(shù)切除標(biāo)本進(jìn)行檢測,分析Crk II蛋白在喉鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)與喉癌患者的臨床分期、病理分級、有無淋巴轉(zhuǎn)移以及年齡的關(guān)系;根據(jù)Gen Bank數(shù)據(jù)庫中人類Crk II基因編碼序列(序列號:NM016823.3),使用Invitrogen公司在線設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)針對CrkⅡ基因的si RNA干擾序列,并設(shè)計(jì)無關(guān)序列作為陰性對照。以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將構(gòu)建好的Crk II RNA干擾質(zhì)粒及陰性對照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至Hep2細(xì)胞中,24h后開始于倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率并拍照,本實(shí)驗(yàn)將分為三組:實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染Crk II RNA干擾質(zhì)粒組)、陰性對照組(轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒)和空白對照組(未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組)。轉(zhuǎn)染成功后,利用real-time PCR檢測Crk II在m RNA水平表達(dá)下調(diào)的情況,Western blot檢測Crk II在蛋白質(zhì)水平表達(dá)下調(diào)的情況,分別通過MMT實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的增殖能力、細(xì)胞的遷移能力、細(xì)胞的侵襲能力。結(jié)果:1.Crk II在22例喉鱗狀細(xì)胞癌癌旁組織中不表達(dá)或少量表達(dá),其陽性表達(dá)率為9.1%;在54例喉鱗狀細(xì)胞癌組織中有37例明顯高表達(dá),Crk II的陽性表達(dá)率為68.5%。喉鱗狀細(xì)胞癌組織中Crk II的陽性表達(dá)率與癌旁組織相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),且Crk II的陽性表達(dá)率在喉鱗狀細(xì)胞癌的臨床分期、病理分級及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.643,χ2=4.987,χ2=3.833,P值均0.05);2.成功構(gòu)建Crk II RNA干擾質(zhì)粒,并將其轉(zhuǎn)染至Hep2細(xì)胞株,轉(zhuǎn)染后可顯著抑制喉癌細(xì)胞系Hep-2細(xì)胞內(nèi)源性Crk II m RNA和蛋白表達(dá)水平(P0.01);3.MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果:轉(zhuǎn)染后檢測實(shí)驗(yàn)組Hep-2細(xì)胞在各時(shí)間點(diǎn)OD值均比空白對照與陰性對照組低(P0.01),且OD值隨著時(shí)間的延長差別也逐漸增大,但陰性對照組與空白對照組的OD值相比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);4.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn):48h時(shí)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞遷移距離比空白對照組和陰性對照組顯著降低(t=8.591、19.666,P0.01),且空白對照組與陰性對照組相比較,遷移距離無明顯差異(t=1.403,P0.05);5.Transwell侵襲實(shí)驗(yàn):結(jié)果顯示陰性對照組和空白對照組穿過基質(zhì)膜到達(dá)下室的平均細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.256,P0.05),實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞穿過基質(zhì)膜到達(dá)下室的平均細(xì)胞數(shù)較空白對照組和陰性對照組均明顯減少(t=10.226、9.707,P0.01)。結(jié)論:1.Crk II蛋白可能通過促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移在喉癌的發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用;2.成功構(gòu)建Crk II RNA干擾質(zhì)粒,能有效下調(diào)Crk II在Hep-2細(xì)胞中的表達(dá);3.下調(diào)喉癌細(xì)胞系Hep-2細(xì)胞中Crk II的表達(dá)后細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力明顯下降,提示Crk II蛋白有望成為喉癌治療的新靶點(diǎn)。
【學(xué)位單位】：貴州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R739.65
【部分圖文】：

貴州醫(yī)科大學(xué) 2018 屆科學(xué)學(xué)位碩士研究生學(xué)位論文表 1-1 針對 CrkII 基因設(shè)計(jì) siRNA 序列及無關(guān)序列Tab. 1-1 siRNA sequence and unrelated Sequence of CrkI靶序列 GGATCAACAGAATCCCGATGA GTTCTCCGAACGTGTCACGT體與構(gòu)建U6/RFP/Neo 表達(dá)載體（圖 1-1），該載體中帶有 RFP（熒光蛋白）表達(dá)基因及 Neomycin 抗性篩選標(biāo)記基因篩選穩(wěn)定表達(dá)的單克隆細(xì)胞系，將設(shè)計(jì)好的 siRNl 酶切位點(diǎn)。CrkII RNA 干擾質(zhì)粒交給上海吉瑪制藥

CCTTGTAGATGAAGCAGCCGTCCTGCAGGGAGGAGTCCTGGGTCACGCCACGCCGCCGTCCTCGAAGTTCATCACGCGCTCCCACTTGAAGCCGGGAAGGACAGCTTCTTGTAGTCGGGATGTCGGCGGGTGCTTCACGCCTTGAGCCGTACTGACTGGGGGGACAGGATGTCC.AGGCGAAGGCGCCGCCCTTGG CrkII RNA 干擾質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染效率.1 CrkII RNA 干擾質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染將 CrkII RNA 干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至 Hep-2 細(xì)胞中，分別于轉(zhuǎn)染后 24 h、48h、倒置熒光顯微鏡下觀察紅色熒光蛋白(RFP)的表達(dá)情況，在 72h 時(shí)可見p-2 細(xì)胞表達(dá)紅色熒光，因此表明，CrkII RNA 干擾質(zhì)�？梢杂行мD(zhuǎn)染至 H胞并穩(wěn)定表達(dá)。如圖 2-2 所示。

貴州醫(yī)科大學(xué) 2018 屆科學(xué)學(xué)位碩士研究生學(xué)位論文2.4.2 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 檢測 CrkII RNA 干擾質(zhì)粒在 mRNA 水平的干擾效率（1）擴(kuò)增曲線和溶解曲線從擴(kuò)增曲線看呈 S 形，平行空間誤差較小，從溶解曲線看沒有出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，特異性可，結(jié)果可信。如圖 2-3 和 2-4
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 李曉明;;喉癌外科手術(shù)及綜合治療專家共識[J];中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志;2014年08期

2 陰傳敏;姚珍薇;令狐華;;信號接頭蛋白crk在宮頸癌Caski細(xì)胞惡性潛能中的作用[J];腫瘤;2009年02期

3 陰傳敏;姚珍薇;令狐華;;信號接頭蛋白Crk在子宮頸癌組織中的表達(dá)和意義[J];重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2008年07期

本文編號：2870595