【摘要】：研究目的甲狀腺相關(guān)眼病(thyroid associated ophthalmopathy,TAO)是眼眶疾病中最常見的一種類型。目前的研究認為其是一種自身免疫性疾病,與甲狀腺功能紊亂有關(guān),常伴發(fā)于毒性彌漫性甲狀腺腫(Graves’disease,GD)。國外研究顯示,每百萬人群中Graves病發(fā)病率為210/年,男女比例為1:3.9,高峰年齡為40-60歲,而TAO的發(fā)病率為42.2/百萬/年,約為Graves甲亢發(fā)病率的20.1%。目前TAO的確切發(fā)病機制仍不明確,缺乏針對性的治療措施,現(xiàn)有治療方案多以控制病情為主。同時由于TAO治療的前提是正確的臨床分期,而目前臨床普遍采用的CAS評分系統(tǒng)存在一定的主觀性,尤其對于非專門從事TAO診治的眼科和全科醫(yī)生,很難做到準確分期。國外有研究發(fā)現(xiàn),Toll樣受體9(Toll-like receptor 9,TLR9)激活可促進漿細胞樣DC(pDC)分泌IFN-α,與SLE的疾病活動性和預后密切相關(guān)。而我們前期研究發(fā)現(xiàn)活動期TAO患者外周血單個核細胞中TLR9表達明顯高于正常人群。因此我們推測TLR9是否同樣參與了TAO的發(fā)病過程,為了驗證這一設(shè)想,通過實驗驗證活動期TAO患者眼眶成纖維細胞(orbital fibroblasts,OFs)是否高表達TLR9,并與穩(wěn)定期TAO進行對比,以期發(fā)現(xiàn)二者之間TLR9表達的差異。進一步探究TLR9與OFs增殖、炎癥因子釋放之間的聯(lián)系,了解TLR9在TAO發(fā)病中的作用,為尋找TAO治療靶點提供依據(jù)和方向。研究方法本課題通過組織塊培養(yǎng)法,分別從活動期TAO患者、穩(wěn)定期TAO患者及排除免疫性疾病為改善外觀而行眼眶減壓手術(shù)的正常人眼眶脂肪結(jié)締組織中分離純化OFs。用實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)方法分析各組TLR9mRNA表達水平的差異。用TLR9特異性配體——人工合成的含有CpG基序的寡脫氧核苷酸(CpG-ODN)刺激各組細胞,分別于刺激后0h、6h、12h、24h用qRT-PCR方法檢測白介素-6(interleukins-6,IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、細胞間粘附分子-1(intercellular adhesion molecular-1,ICAM-1)、干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)mRNA表達水平的變化趨勢,并分別用不同濃度CpG ODN刺激各組OFs,作用不同時間,通過CCK8法測定各組細胞OD值的變化,計算細胞活力,了解TLR9與OFs增殖之間的聯(lián)系。最后用特異性小干擾RNA(Small interfering RNA,siRNA)下調(diào)TLR9 mRNA的表達水平,再次用qRT-PCR法檢測活動期TAO組TLR9、IL-6、IFN-γ、ICAM-1 mRNA表達水平,驗證TLR9與炎癥因子IL-6、IFN-γ、ICAM-1合成和分泌之間的相關(guān)性。結(jié)果1、經(jīng)組織塊培養(yǎng)法成功獲得各組OFs,經(jīng)形態(tài)學及免疫組化鑒定符合成纖維細胞特征。2、TLR9 mRNA在活動期TAO組OFs中表達水平明顯高于正常對照組,而在穩(wěn)定期TAO組中表達下調(diào)。3、CpG-ODN刺激各組細胞后,活動期TAO組OFs活力明顯升高,而穩(wěn)定期TAO組和正常對照組無明顯變化,這種作用在CpG-ODN作用48h后顯現(xiàn),并且存在劑量依賴,在200nM時最明顯。4、CpG-ODN刺激各組細胞后,活動期TAO組OFs相關(guān)炎癥因子(IL-6、TNF-α、ICAM-1、IFN-γ)mRNA的表達水平均不同程度升高,穩(wěn)定期TAO組OFs升高幅度不明顯,部分出現(xiàn)下調(diào)。5、用siRNA下調(diào)活動期TAO組OFs TLR9 mRNA表達水平后,相關(guān)炎癥因子(IL-6、IFN-γ、ICAM-1)mRNA的表達水平亦呈現(xiàn)下降趨勢,呈正相關(guān)。結(jié)論1、組織塊培養(yǎng)法獲取OFs是可靠而有效的。2、TAO活動期患者來源的OFs高表達TLR9,而穩(wěn)定期患者來源的OFs相對低表達,提示TLR9可能參與TAO活動期炎癥反應(yīng)過程。3、用特異性配體激活TLR9后,OFs的細胞活力明顯提高,提示TLR9被激活可能參與了TAO活動期眼外肌增生和眶脂肪增多的病理過程。4、TLR9激活后,可誘導活動期OFs合成和分泌IL-6、TNF-α、ICAM-1、IFN-γ等炎癥因子,說明TLR9可能參與了TAO活動期眼眶炎癥反應(yīng)過程。
【學位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R581;R771.3
【圖文】：

圖 2.細胞鑒定結(jié)果，A. Vimentin 染色（+）（×400），B.CK 染色（-）（×400），C. Desm色（-）（×400），D. S-100 染色（-）（×400）二、實時熒光定量 PCR（Quantitative Real-time PCR）測各組 OFs 中 TLR9 mRNA 表達水平

圖 3.三組 OFsTLR9 mRNA 相對表達水平CpG-ODN 激活 TLR9 后，OFs 增殖活力的）、時間效應(yīng)數(shù)生長期的細胞，消化后，按 5×103cell/孔接種于 96 孔

圖 4.CpG-ODN（200nM）刺激后各組細胞活力時間曲線）、劑量效應(yīng)組對數(shù)生長期的細胞，消化后，按 5×103cell/孔接種于 96 孔板中CO2 孵箱培育 24 小時，待細胞貼壁生長后，分別給予不同濃度 小時后進行 CCK8 實驗，測定各孔 OD 值（剔除每組數(shù)據(jù)中偏差

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10 葉玲;潘慶軍;唐德q

本文編號：2754506