發(fā)布時間：2020-06-20 21:26

【摘要】：研究背景慢性鼻竇炎(Chronic rhinosinusitis,CRS),是耳鼻喉科的最常見的疾病之一,一般指持續(xù)超過12周的鼻腔與鼻竇粘膜的慢性炎癥。多中心統(tǒng)計研究表明不同國家的CRS發(fā)病率均有逐年增加的趨勢。CRS雖然不是致命性疾病,卻導致病人很多功能、記憶及感情方面的損害。隨著鼻用藥物及功能性內(nèi)鏡鼻竇手術的發(fā)展,CRS的診療水平有了很大的進步,但是臨床工作中仍發(fā)現(xiàn)很多復發(fā)的病人。這類病人即使經(jīng)規(guī)范的藥物治療及多次鼻內(nèi)鏡翻修手術,治療效果仍不盡如人意,這可能與CRS的復雜的病因?qū)W及發(fā)病機制尚不清除有關。目前認為致病的主要因素有:細菌、病毒感染;鼻腔解剖結構異常;上皮細胞功能障礙;變態(tài)反應及免疫功能下降等,其中細菌感染是CRS公認的重要致病因素之一。脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)為革蘭氏陰性桿菌細胞壁外膜的重要組成部分,能激活單核-巨噬細胞胞,炎癥細胞大量浸潤,釋放白介素、腫瘤壞死因子等活性物質(zhì),引起炎癥反應。鼻腔粘膜的上皮細胞是一道天然的屏障,具有活躍的分泌功能,在外界理化因素的刺激下,釋放細胞因子作用于其他細胞,在鼻腔、鼻竇的慢性炎癥、損傷修復及重塑過程中起著重要作用。細胞自噬(Autophagy)是真核生物細胞中維持細胞生存,緩解細胞內(nèi)外壓力的重要代謝過程。細胞在內(nèi)外環(huán)境壓力變化下,形成一種雙層膜的吞噬泡(phagophore),包裹細胞內(nèi)損壞的長周期蛋白、變性壞死的細胞器或入侵的病原體形成自噬體,然后在細胞骨架微管網(wǎng)絡系統(tǒng)的作用下與溶酶體融合,在溶酶體酸性水解酶的作用下進一步消化降解,為細胞的再循環(huán)提供原料和能量。然而,在一定條件下,自噬溶酶體過量降解了正常的細胞器和長周期蛋白導致細胞主動性死亡,即細胞自噬死亡(Autophagic cell death)。細胞自噬是一個非常復雜的動態(tài)連續(xù)的過程,自噬在不同疾病甚至在同一疾病的不同階段扮演著不同的角色。研究表明,有30多種分子組成不同的信號通路調(diào)控自噬,這些分子統(tǒng)稱為Atg(Autophagy-related)家族。微管相關蛋白 1 輕鏈 3(Microtubule-associated protein lA/1B-1ightchain3,LC3)是自噬過程的關鍵蛋白,貫穿于自噬的全過程,是酵母Atg8的同源物。當自噬發(fā)生時,LC3先被Atg4裂解形成水溶性LC3-Ⅰ,然后在Atg7和Atg3的催化下,與脂酰乙醇胺結合脂化形成LC3-Ⅱ。脂溶性的LC3-Ⅱ成為自噬體的內(nèi)外膜上的標記蛋白,其含量與自噬體的數(shù)量成正比。LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ已被公認為是Western blot檢測自噬的金標準。近年來自噬在呼吸系統(tǒng)疾病(如呼吸道感染、支氣管哮喘、慢性阻塞性肺疾病等)發(fā)病機制的研究中取得了長足的進步。Tanaka A等人發(fā)現(xiàn)吸煙導致氣道上皮細胞產(chǎn)生活性氧分子,通過磷酸化JNK激活LC3-Ⅱ,使用抗氧化劑可抑制LC3-Ⅱ的表達。在哮喘的發(fā)病過程中,自噬可影響Thelper(Th)1、Th2的分化及平衡,介導哮喘相關病原體的免疫炎癥反應。Dickinson JD等人研究認為IL-13能通過誘導自噬調(diào)節(jié)呼吸道杯狀細胞的合成與分泌;Martin等人報道兒童哮喘與Atg5和Atg7的多態(tài)性相關,急性哮喘發(fā)作的患者中鼻腔粘膜上皮細胞Atg5的表達明顯高于對照組。呼吸道的粘膜均來源于原腸胚內(nèi)胚層,粘膜上皮細胞以假復層纖毛柱狀上皮為主。鼻腔、鼻竇粘膜與呼吸道粘膜相互延續(xù),很多疾病存在多方面的相互作用和影響,近年來學者提出“同一氣道,同一疾病”的理論。因而,我們推測CRS的鼻粘膜上皮細胞的自噬水平是否發(fā)生變化,查找國內(nèi)外文獻僅有臺灣課題組研究認為鼻息肉的自噬水平降低,與環(huán)氧合酶-2高表達有關,而CRS的鼻粘膜上皮細胞自噬水平未見報道。自噬在CRS發(fā)病機制中扮演的角色需要進一步研究和探討。本課題第一部分先從mRNA、蛋白水平檢測自噬標志蛋白LC3在CRS組織中的表達情況;分離培養(yǎng)CRS的原代人鼻粘膜上皮細胞,利用透射電鏡及熒光顯微鏡觀察自噬表達情況。第二部分用LPS刺激人正常鼻粘膜上皮細胞,檢測不同濃度LPS對人鼻粘膜上皮細胞增殖及凋亡的影響;利用透射電鏡及GFP-LC3融合蛋白熒光顯微鏡下觀察自噬的標志結構;Western blot檢測LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及自噬相關通路蛋白的表達水平,探討AMPK-mTOR信號通路在LPS誘導的人鼻粘膜上皮細胞自噬中的作用及TLR4/MyD88信號通路與自噬的關系。第一部分慢性鼻竇炎中鼻腔粘膜上皮細胞自噬水平的初步研究研究目的:從mRNA、蛋白水平檢測LC3-Ⅱ在CRS中的表達水平;分離培養(yǎng)CRS的原代鼻粘膜上皮細胞,利用透射電鏡及免疫熒光顯微鏡分別觀察自噬體及GFP-LC3融合蛋白表達情況。實驗方法:1.術中收集18例慢性鼻竇炎(不伴有息肉)患者和10例對照組的鉤突粘膜作為樣本。2.利用免疫組織化學染色法分別檢測LC3-Ⅱ在CRS組和對照組中的定位及表達水平的差異。3.TRIzol法從28例樣本中提取總RNA,反向轉(zhuǎn)錄為cDNA,用qRT-PCR方法比較了兩組樣本中LC3表達差異。4.分離培養(yǎng)CRS及對照組的人鼻粘膜上皮原代細胞,透射電鏡觀察CRS組細胞內(nèi)的自噬體并計數(shù);通過轉(zhuǎn)染帶熒光標記GFP-LC3質(zhì)粒,熒光顯微鏡下觀察帶有綠色熒光的自噬體的分布狀態(tài)并統(tǒng)計分析。5.結果用SPSS18.0軟件分析,用Fisher檢驗分析結果,P0.05時表示差異有統(tǒng)計學意義。實驗結果:1.免疫組織化學染色結果顯示,CRS組和對照組鉤突粘膜組織中LC3-Ⅱ均表達在細胞質(zhì)中,弱陽性及陽性時呈黃色、棕黃色;強陽性時呈棕褐色,細胞膜和間質(zhì)也可染色。LC3-Ⅱ在88.9%(16/18)CRS鉤突粘膜組織中高表達,而僅在30%(3/10)的對照組中高表達,差異顯著(P = 0.003)。2.qRT-PCR結果顯示LC3-Ⅱ mRNA在CRS組和對照組鉤突粘膜組織中相對表達量均值分別為(3.188±0.3887)和(1.025±0.1543)。統(tǒng)計學分析顯示,LC3-ⅡmRNA在CRS組中表達明顯增加(P0.001)。3.透射電鏡下,分離培養(yǎng)的CRS的鼻粘膜上皮原代細胞可觀察到典型雙層膜結構的自噬小體。4.將GFP-LC3質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染CRS鼻粘膜上皮原代細胞,熒光顯微鏡觀察到CRS組綠色的熒光點主要表達在細胞質(zhì)中,而對照組的鼻粘膜上皮原代細胞僅可見少量的熒光點,差異顯著。結論:CRS的鼻腔粘膜上皮細胞自噬水平明顯上調(diào),提示自噬可能參與了 CRS的致病過程。第二部分脂多糖通過AMPK-mTOR信號通路調(diào)控人鼻粘膜上皮細胞自噬的分子機制研究研究目的:探討AMPK-mTOR信號通路在LPS誘導的人鼻粘膜上皮細胞自噬中的作用及TLR4/MyD88信號通路與自噬的關系實驗方法:1.建立LPS感染人正常鼻粘膜上皮細胞的模型,CCK-8檢測不同濃度LPS對人鼻粘膜上皮細胞增殖的影響;流式細胞儀分析不同濃度LPS對人鼻粘膜上皮細胞凋亡的影響。2.不同濃度LPS(0、1、5、10μg/ml)處理人鼻粘膜上皮細胞12h;另外一組加入10μg/ml的LPS,培養(yǎng)不同時間(0、6、12、24h)后,分別收集細胞,提取總蛋白,Western blot檢測LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值和SQSTM1(P62)蛋白表達水平,測定不同濃度和不同處理時間對自噬的影響。3.透射電鏡觀察LPS處理后的鼻粘膜上皮細胞內(nèi)含有雙層膜的自噬小體并計數(shù)。4.通過瞬時轉(zhuǎn)染帶熒光標記GFP-LC3質(zhì)粒的方法,熒光顯微鏡下觀察人鼻粘膜上皮細胞中的綠色熒光點的分布狀態(tài)并計數(shù)。5.采用不同濃度(0、1、5、10μ/ml)LPS刺激人鼻粘膜上皮細胞,檢測自噬相關蛋白 P-AKT(Ser473)、AKT、P-AMPK(Tyr1 72)、AMPK、P-mTOR(Ser2448)、mTOR的表達情況;進一步使用AMPK抑制劑Compound C和LPS共同培養(yǎng)人鼻粘膜上皮細胞,測定自噬通路相關蛋白的表達情況。6.利用CRS與正常粘膜組織分離培養(yǎng)的鼻腔粘膜的上皮原代細胞,Western blot檢測 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值以及 P62、P-AMPK、AMPK、P-mTOR、mTOR 蛋白表達水平,進一步驗證信號通路。7.采用不同濃度(0、1、5、10μg/ml)LPS處理人鼻粘膜上皮細胞,檢測TLR4、MyD88及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白的表達情況;使用TLR4抑制劑Polymyxin B和LPS共同刺激人鼻粘膜上皮細胞,檢測LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及TLR4、MyD88蛋白的表達情況。實驗結果:1.不同濃度LPS處理后,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值隨著濃度增加而逐漸升高,差異最明顯是10μg/ml刺激組(P0.01),P62的表達水平則逐漸降低;同一濃度處理人鼻粘膜上皮細胞后,隨著刺激時間的延長,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值逐漸升高,在12h處達到峰值,差異顯著(P0.01),24h時表達水平有所下降,但與對照組仍有差異(P0.05),P62蛋白的表達水平則相反。2.用10μg/mlLPS與人鼻粘膜上皮細胞共培養(yǎng)12h后,在透射電鏡下可觀察到融合的雙層膜的自噬囊泡、自噬溶酶體及降解后的自噬空泡。3.將瞬時轉(zhuǎn)染GFP-LC3質(zhì)粒的人鼻粘膜上皮細胞在不同濃度(0、1、5、10μg/ml)LPS刺激12h后,熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)聚集的GFP-LC3主要分布在細胞質(zhì),隨著刺激濃度的升高,帶有熒光點自噬體的陽性細胞比例顯著增加,這與免疫印跡結果一致。4.用LPS處理人鼻粘膜上皮細胞后,隨著刺激濃度的增加,P-AMPK表達量逐漸增高,P-mTOR表達量逐漸降低,而p-AKT沒有明顯的變化;使用AMPK抑制劑Compound C后,P-AMPK、P-mTOR的表達量及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值介于對照組與LPS處理組之間。5.利用CRS與正常粘膜組織分離培養(yǎng)的鼻腔粘膜的上皮原代細胞,Western blot結果顯示CRS組的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明顯升高,P62表達量降低;同時P-AMPK蛋白相對表達量增多,P-mTOR的相對表達量減少。6.隨著LPS刺激濃度的增加,TLR4、MyD88蛋白相對表達量及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值逐漸升高;進一步使用TLR4抑制劑Polymyxin B,TLR4、MyD88的表達量及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均介于對照組與LPS組之間。結論:1.LPS能誘導人鼻粘膜上皮細胞產(chǎn)生自噬,并呈劑量-效應和時間-效應依賴關系。2.LPS通過AMPK-mTOR信號通路誘導人鼻粘膜上皮細胞產(chǎn)生自噬。3.TLR4/MyD88依賴的信號通路也參與了 LPS誘導的人鼻粘膜上皮細胞的噬。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R765.41
【圖文】：

圖２邋ｑＲＴ－ＰＣＲ結果逡逑

圖３自噬小體在人鼻粘膜上皮原代細胞的表達情況逡逑圖Ａ顯示在ＣＲＳ培養(yǎng)的人鼻粘膜原代上皮細胞可見雙層膜的自噬小體，而對未見明顯自噬小體。逡逑Ｂ對照組與３例ＣＲＳ培養(yǎng)的鼻粘膜上皮細胞自噬小體的定量分析（＊＊邋Ｐ＜逡逑．０１＊＊＊邋Ｐ＜邋０．００１）。逡逑３

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本文編號：2722994