【摘要】：聽力損失或耳聾(hearing loss)是一種常見的耳鼻咽喉科疾病。2013年世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計顯示全球已有高達3.6億聽力殘障人士。耳聾患者通常伴有不同程度的耳鳴、眩暈、失眠、焦慮、抑郁,甚至恐懼和外人交流,導致患者生理和心理都面臨相當大地痛苦,生活質量明顯下降,因而如何預防和治療聽力損失或耳聾已成為全球關注的公共健康問題。病因學研究認為耳聾可由遺傳、感染、藥物、噪音、創(chuàng)傷、衰老以及自身免疫等因素誘發(fā)。其中,自身免疫性內耳病(Autoimmune inner ear disease,AIED)是少數(shù)進展迅速,但經(jīng)及時、恰當治療后可部分或全部逆轉的病因之一。因此,探究AIED發(fā)病機制以及探尋如何及時診斷并有效治療AIED具有重要的臨床意義。近年研究認為內淋巴囊(endolymphatic sac,ES)是內耳的組成性免疫防御系統(tǒng)。當內耳受抗原刺激后,ES部位的免疫活性細胞一方面通過增殖分化大量增加,另一方面通過釋放的炎癥介質介導全身血流循環(huán)中炎癥細胞的招募,進而放大ES的免疫作用,完成抗原捕捉、吞噬和清除過程。若持續(xù)且過于強烈的免疫應答反應發(fā)生,則可引發(fā)耳蝸組織發(fā)生一些病理性改變,最終導致AIED形成。由此提示,靶向ES的免疫或炎癥相關基因可能是治療AIED的潛在途徑。但目前關于ES中參與免疫或炎癥的基因仍知之甚少。由于無法進行活體內耳組織檢查,目前AIED診斷主要通過臨床癥狀、實驗室檢查以及影像學檢查進行綜合判斷。其中,血液檢測是最主要的手段,包括特異性抗原(如HSP-70)、免疫相關的細胞(如淋巴細胞)以及分泌的細胞因子(如TNF)。盡管如此,目前臨床上用于診斷AIED的標志物仍然有限,需進一步探尋。miRNAs是一類分子大小約為22個核苷酸的內源性非編碼單鏈小RNA,其通過轉錄后水平抑制靶基因的表達,從而參與調控疾病的發(fā)生、發(fā)展及預后。因此,調控免疫或者炎癥因子的miRNA可能是潛在的診斷AIED的分子標志物。目前已有文獻探討了 miRNAs對自身免疫性甲狀腺疾病以及自身免疫性胰腺炎的診斷性能,但關于AIED相關的miRNAs還少見報道�；谀壳按嬖诘膯栴},本論文擬主要開展了以下三個方面的工作:第一部分:研究目的:利用ES轉錄組芯片數(shù)據(jù)篩選炎癥相關的基因,為AIED治療提供潛在的靶點。研究方法:從公共數(shù)據(jù)庫歐洲生物信息研究所下載E-MEXP-3022數(shù)據(jù),此數(shù)據(jù)包含6個大鼠樣本,即3個ES樣本以及3個純的ES旁硬腦膜組織。利于RMA(Robust Multichip Average)算法進行原始數(shù)據(jù)的預處理;運用微陣列數(shù)據(jù)法線性模型(linear model for microarray data methods,LIMMA)篩選樣本間的差異表達基因(differentially expressed genes,DEGs)。閾值設定為P值0.05且丨log2FC|1;使用DAVID在線工具分別預測上調和下調基因可能參與的功能(gene ontology,GO)和信號通路(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG);使用 STRING 數(shù)據(jù)庫預測分析 DEGs 編碼的蛋白質之間的互作關系,采用Cytoscape軟件進行PPI網(wǎng)絡構建,隨后采用CytoNCA插件計算蛋白質網(wǎng)絡節(jié)點的拓撲學特征(包括節(jié)點的度、介數(shù)中心性以及子圖中心性)以篩選網(wǎng)絡中的關鍵基因;采用Cytoscape軟件的ClusterONE插件挖掘PPI網(wǎng)絡中存在的功能相關且基因之間緊密聯(lián)系的模塊,隨后對每個子網(wǎng)絡同樣進行功能富集分析;為了從多角度和多物種水平確認基因的重要性,我們將從大鼠篩選到的DEGs與2015年M(?)ller等鑒定的人的ES組織炎癥,免疫相關基因取交集,以獲得共同的基因。研究結果:根據(jù)設定的閾值,我們發(fā)現(xiàn)ES和對照組織之間有612個基因表現(xiàn)差異表達,包括396個上調和216個下調基因。功能富集分析結果表明上調DEGs富集到116個顯著的GO條目,包括細胞粘附GO:0007155-cell adhesion(富集的基因包含Itgal 和 Spp1);T 細胞協(xié)同刺激 GO:0031295-T cell co-stimulation(富集的基因包含Cc121和Cc119);細胞因子IL-1應答GO:0070555-response to IL-1(富集的基因包含Cc121和Cc19),而下調DEGs富集到77個顯著的GO條目,同樣主要參與細胞粘附(GO:0007155～cell adhesion,富集的基因包含Tgfbi),炎癥性Toll受體信號通路(GO:0002224～toll-like receptor signaling pathway,富集的基因包含 Tlr2,Tlr7,Tlr8)以及陽性調節(jié) NF-kB 入核(GO:0042346～positive regulation of NF-kappaB import into nucleus,富集的基因包含Tlr2和Tlr7)。上調DEGs富集到6個顯著的KEGG通路,包括緊密連接(rno04530:Tight junction,富集基因包括 Cldn4),ECM 受體互作(rno04512:ECM-receptor interaction,富集基因包括Itgal和Sppl),白細胞跨內皮轉移(rno04670:Leukocyte transendothelial migration,富集基因包括 Cldn4),而下調基因富集到7個KEGG通路,包括炎癥相關的疾病通路,如瘧疾(rno05144:Malaria,富集的基因包含Tgfb3和Tlr2)。將所有的差異基因映射到從STRING數(shù)據(jù)庫獲得的蛋白互作關系對,結果構建成一個包含338個節(jié)點和777個PPI對的PPI網(wǎng)絡。隨后通過計算三種拓撲學特征,發(fā)現(xiàn)Itgal和Spp1是潛在重要的基因。采用ClusterONE方法從PPI網(wǎng)絡中提取出5個顯著的、蛋白之間緊密關的子網(wǎng)絡。其中模塊1和模塊2顯著富集到炎癥(包含Ccl21和Ccl19基因)以及細胞粘附(包括Cldn4基因)相關的通路。通過和2015年M(?)ller等的研究炎癥基因取交集,結果獲得了 6個共同的基因,包括Tlr7,Tlr2,Tlr8,Lpo,Gzmm以及Mucl。功能分析證明Tlr7,Tlr2,Tlr8和Gzmm富集到免疫相關的通路。研究結論及意義:ES 組織中 Itga1、Spp1、Ccl21、Ccl19、Cldn4、Tlr7、Tlr2 以及Tlr8的異常表達可能是AIED發(fā)生的潛在機制。第二部分:研究目的:采用miRNA二代測序技術鑒定與AIED顯著相關的生物標志物。研究方法:提取豚鼠內耳膜組織制備內耳抗原,隨后與同體積的完全弗氏佐劑混合,頸背部皮下多點注射構建AIED模型。于免疫一周和兩周后分別選取部分豚鼠處死以采用病理組織學分析判斷模型的成功性。收集3只成功建模的AIED鼠和對照正常鼠的血清樣本進行miRNA深度測序。采用FastQC軟件對原始Fastq文件數(shù)據(jù)進行質量控制,去除接頭序列以及低質量的序列;采用miRDeep2對的miRNA數(shù)據(jù)定性,定量和歸一化,隨后采用Student's進行差異表達miRNAs的篩選。差異表達miRNA閩值設定為:p0.05;差異倍數(shù)1.5或1/1.5;表達均值log2(5RPM);采用TargetScan(物種選為Mouse)算法進行鼠源差異表達miRNA的靶基因預測,miRNA-靶基因互作調控網(wǎng)絡采用Cytoscape軟件進行展示;采用clusterProfiler對網(wǎng)絡基因進行GO和KEGG通路富集分析。研究結果:病理學檢測結果發(fā)現(xiàn)免疫1周后,豚鼠蝸軸出現(xiàn)少量炎性細胞(主要是淋巴細胞)浸潤;螺旋神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量明顯減少,排列稀疏紊亂;Cortis器皺縮,偶有內、外毛細胞缺失、壞死;可見少量壺腹嵴毛細胞空泡變性。說明AIED模型已構建成功,隨后采用免疫一周的樣本進行miRNA表達譜分析。根據(jù)設定的閾值,在兩組樣本之間共檢測到22個差異表達miRNA,包括10個上調表達和12個下調表達。利用TargetScan軟件,我們?yōu)?2個差異表達的miRNA預測到1958個潛在的靶基因。隨后利用它們之間的互作構建了 miRNA-mRNA調控網(wǎng)絡,其包含22個miRNAs和1696個靶基因。采用clusterProfiler對差異miRNA的靶基因進行功能分析,結果發(fā)現(xiàn)分別有8個miRNA的靶基因富集到GO條目(miR-10b-3p,let-7j,miR-1943-5p,miR-196b-5p,miR-338-3p,miR-455-5p,miR-8112,miR-92b-3p)和 KEGG 通路(miR-10b-3p,let-7c-5p,let-7g-5p,let-7j,miR-181c-5p,miR-181d-5p,miR-222-3p,miR-8112)。其中三個miRNAs的靶基因在GO和KEGG通路分析時都富集到,包括miR-10b-3p,let-7j以及miR-8112。其中,miR-10b-3p主要通過調控炎性趨化因子(如Ccl12)來參與AIED;miR-8112主要通過靶向影響Wnt信號通路基因,包括Wnt9b,wnt 3a,Wnt2b;let-7j的靶基因主要參與鞘糖脂合成以及黏蛋白型O-聚糖的合成,如Galnt2。研究結論及意義:血清miR-10b-3p、miR-8112以及l(fā)et-7j可能是潛在的診斷AIED的生物標記物。它們主要通過參與調控炎癥相關靶基因來預測AIED的發(fā)病。第三部分:研究目的:整合分析ES組織轉錄組和血清miRNA表達譜數(shù)據(jù)以獲得調控ES的miRNAs,為臨床診斷和治療提供靶點。研究方法:采用Venn圖對比分析大鼠ES組織中篩選的612差異基因和小鼠血清中篩選的差異miRNA的1958個靶基因,獲得它們之間共同的基因。使用在線DAVID工具分別以大鼠和小鼠為物種預測共同基因參與的功能,包括GO和KEGG信號通路途。P0.05被視為顯著富集結果。研究結果:韋恩圖結果顯示大鼠ES組織中篩選的612差異基因和小鼠血清中篩選的差異miRNA的1958個靶基因之間有44個是共同的。采用大鼠作為物種,DAVID富集分析證明上述44個基因可參與10個GO條目,而采用小鼠作為物種,則可獲得13個GO條目。其中兩個物種分析都獲得可以參與細胞粘附的細胞外基質相關的 GO 條目,包括 G0:0005578～proteinaceous extracellular matrix 和GO:0031012～extracellular matrix。富集到的基因包含 SBSPON、VWF、WNT16、ADAMTS8、SFRP1、LAMC2、ADAMTS12、PLSCR1。這些基因依次分別受到miR-1943-3p、miR-532-3p、let-7g-5p、miR-340-3p、miR-874-3p 以及 miR-511-3p 的調控。其中miR-511-3p和其靶點基因ADAMTS12的表達方向是相反,間接證明它們之間的負調控關系。此外,以大鼠為物種還發(fā)現(xiàn)共同基因可與富集到T細胞協(xié)同刺激的GO條目GO:0031295～T cell costimulation,證明這些富集的基因(EFNB3,DPP4)是參與AIED發(fā)生發(fā)展的重要靶點。EFNB3可受到miR-1943-5p的調控,而DPP4受miR-196-5p的調節(jié),且這兩組miRNA-mRNA之間的表達都是負相關的。研究結論及意義:miR-511-3p-ADAMTS12,miR-1943-5p-EFNB3 以及 miR-196-5p-DPP4互作對通過參與細胞外基質粘附和T細胞協(xié)同刺激來促進AIED的發(fā)生,因此它們可能是AIED診斷和治療的潛在靶點。
【圖文】：

因表現(xiàn)出差異表達，包括３９６個上調基因和２１６個下調基因（表２．１）。熱圖分析表逡逑明所鑒定的ＤＥＧｓ可以明顯的將ＥＳ和對照組區(qū)分開來，，證明了邋ＤＥＧｓ的有效性。差異表逡逑達基因的ｈｅａｔｍａｐ圖見圖１，可以將樣本正確的分為兩類（圖２．邋１）。逡逑３０逡逑

圖２．２邋ＰＰＩ網(wǎng)絡
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R764.3

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 豆玉鳳;張國成;孫新;劉穎悅;王楠;黃娜;;基因表達譜技術:貴亦需有道[J];醫(yī)學爭鳴;2010年04期

2 潘海燕,朱軍,韓丹夫;分析基因表達譜數(shù)據(jù)的新方法(英文)[J];浙江大學學報(農(nóng)業(yè)與生命科學版);2004年05期

3 吳斌,黃信勇,王米渠,李常度;運用基因芯片研究骨關節(jié)炎虛寒證的基因表達譜述要[J];中醫(yī)藥學刊;2004年11期

4 韓光明,陳順樂,沈南,王元;聚類分析在自身免疫病基因表達譜研究中的初步應用[J];中華檢驗醫(yī)學雜志;2003年08期

5 孫德利,舒琦瑾;基因表達譜在中醫(yī)藥研究中的意義[J];中國中醫(yī)藥信息雜志;2002年01期

6 張渝;劉玉潔;郭丹妮;李惠敏;秦新民;;基于高通量測序的數(shù)字基因表達譜技術研究進展[J];北方園藝;2015年10期

7 劉先鋒;盧學春;范利;高燕;馬聰;羅蕓;;奧美拉唑對人臍靜脈內皮細胞全基因表達譜的影響及機制分析[J];南方醫(yī)科大學學報;2012年04期

8 徐持華;張國良;夏穎;李玲;畢勇毅;;聚類分析在苯中毒患者腫瘤相關基因表達譜研究中的應用[J];數(shù)理醫(yī)藥學雜志;2006年02期

9 ;我國發(fā)現(xiàn)Ⅰ型糖尿病的多基因表達譜,有助于該病的預測[J];生物學教學;2014年09期

10 姜琳穎;余東海;石鑫;;基于加權極限學習機的腫瘤基因表達譜數(shù)據(jù)分類[J];東北大學學報(自然科學版);2017年06期

相關會議論文 前10條

1 劉艷;李康;傅松濱;;基于小波分析理論的基因表達譜數(shù)據(jù)分析方法的研究[A];中國的遺傳學研究——中國遺傳學會第七次代表大會暨學術討論會論文摘要匯編[C];2003年

2 韋朝領;高香鳳;江昌俊;;茶樹對茶尺蠖取食誘導的基因表達譜差異初探[A];第四屆海峽兩岸茶業(yè)學術研討會論文集[C];2006年

3 趙麗婷;郭長江;吳健全;楊繼軍;韋京豫;王宇平;高蔚娜;;槲皮素對大鼠肝臟基因表達譜的影響[A];中國營養(yǎng)學會特殊營養(yǎng)第七屆學術會議會議資料匯編[C];2009年

4 張巖;張亮;周一鳴;安爽;果德安;周玉祥;曾令文;程京;;抗真菌物質與酵母細胞作用后全基因表達譜的聚類法分析[A];第九次全國生物物理大會學術會議論文摘要集[C];2002年

5 高瑞蘭;陳小紅;林筱潔;錢煦岱;徐衛(wèi)紅;吳超群;;三七皂苷誘導造血細胞基因表達譜的研究[A];第八屆全國中西醫(yī)結合血液病學術會議論文集[C];2007年

6 文志寧;張娟;張麗芳;蔣麗娜;李益洲;李夢龍;;癌癥樣本基因表達譜數(shù)據(jù)的解析與建模[A];第十一屆全國計算（機）化學學術會議論文摘要集[C];2011年

7 高瑞蘭;陳小紅;林筱潔;錢煦岱;徐衛(wèi)紅;吳超群;;三七皂苷誘導造血細胞基因表達譜的研究[A];第三屆海峽兩岸中西醫(yī)結合學術研討會論文集[C];2005年

8 高瑞蘭;陳小紅;林筱潔;錢煦岱;徐衛(wèi)紅;吳超群;;三七皂苷誘導造血細胞基因表達譜的研究[A];2005年華東六省一市血液病學學術會議暨浙江省血液病學學術年會論文匯編[C];2005年

9 高瑞蘭;陳小紅;林筱潔;錢煦岱;徐衛(wèi)紅;吳超群;;三七皂苷誘導造血細胞基因表達譜的研究[A];全國中西醫(yī)結合血液病學術研討會、浙江省中西醫(yī)結合學會血液病專業(yè)委員會成立大會首次學術年會暨繼續(xù)教育學習班論文匯編[C];2006年

10 高瑞蘭;陳小紅;林筱潔;錢煦岱;徐衛(wèi)紅;吳超群;;三七皂苷誘導造血細胞基因表達譜的研究[A];2006年浙江省血液病學學術年會論文匯編[C];2006年

相關重要報紙文章 前10條

1 群芳;科學家發(fā)現(xiàn)幽門螺桿菌運動及致病基礎[N];科學時報;2010年

2 記者 張曄 通訊員 周偉;我學者發(fā)現(xiàn)多基因表達譜[N];科技日報;2014年

3 余志平;尋找遺傳學線索 提高化療效果[N];中國醫(yī)藥報;2003年

4 記者 衣曉峰　通訊員 李小蓮;探尋“證”的基因表達譜[N];中國中醫(yī)藥報;2009年

5 王雪飛 吳志軍;我國建立大規(guī)模人胎肝基因表達譜[N];健康報;2006年

6 ;聚類分析在自身免疫病基因表達譜研究中的初步應用[N];中國醫(yī)藥報;2003年

7 趙紹華;給孩子減肥必須“餓一餓”[N];健康時報;2007年

8 小依;回首 只因驕傲[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2001年

9 本報記者 耿挺;生物節(jié)律紊亂基因編輯獼猴克隆成功[N];上�？萍紙�;2019年

10 周艷萍;尋求腫瘤個體化治療方案[N];健康報;2006年

相關博士學位論文 前10條

1 劉健;基于機器學習的腫瘤基因表達譜數(shù)據(jù)分析方法研究[D];中國礦業(yè)大學;2018年

2 張菊紅;自身免疫性內耳疾病相關的分子機制研究[D];山東大學;2018年

3 胡艷紅;白蠟蟲脂酰輔酶A還原酶基因（EpFAR）的克隆表達與功能研究[D];南京林業(yè)大學;2018年

4 程虹;調控miRNA成熟的相關基因SNPs與肺結核易感性的相關性研究[D];新疆醫(yī)科大學;2019年

5 王棟;ARDS患者循環(huán)中性粒細胞和脂多糖誘導人肺微血管內皮細胞表達譜分析[D];山東大學;2019年

6 楊希林;EMP1基因在頭頸部鱗癌中的作用及機制研究[D];武漢大學;2016年

7 陳濤;基因表達譜的數(shù)據(jù)挖掘方法研究[D];西北工業(yè)大學;2016年

8 張寶剛;銅離子激發(fā)擬南芥免疫機制的研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學;2018年

9 王士奇;先天性肛門直腸畸形發(fā)病的基因網(wǎng)絡調控機制研究[D];重慶醫(yī)科大學;2016年

10 王全順;白血病細胞WT1基因的表達機理[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進修學院;2004年

相關碩士學位論文 前10條

1 黃現(xiàn)代;基于SVM的DNA微陣列數(shù)據(jù)分類研究[D];西南科技大學;2018年

2 胡曉燕;基于先驗信息和二進制粒子群優(yōu)化的基因表達譜數(shù)據(jù)處理的研究與實現(xiàn)[D];江蘇大學;2019年

3 王丹丹;黃瓜CsMPC1和CsE1α基因在線粒體介導植物PCD中的作用研究[D];哈爾濱師范大學;2019年

4 袁祝婷;褐飛虱長鏈非編碼RNA基因BPHOGS10005591-OT2的表達及功能分析[D];南京農(nóng)業(yè)大學;2017年

5 申鑫;新mitomiR的發(fā)現(xiàn)及靶基因的確定[D];天津體育學院;2019年

6 葉小泉;面向基因表達譜數(shù)據(jù)分類的特征選擇方法研究[D];廈門大學;2018年

7 石曉光;基于CRISPR/Cas9基因編輯技術的SCN1A-K0模型的RNA-seq分析[D];寧夏醫(yī)科大學;2019年

8 汪羚;家蠶感染BmCPV過程中調控激素水平相關基因的研究[D];江蘇科技大學;2019年

9 池美容;在缺乏正常對照樣本條件下識別疾病相關的差異表達基因[D];福建醫(yī)科大學;2018年

10 李珊;基于生物信息學方法探討心肌梗死相關差異表達基因的研究[D];南方醫(yī)科大學;2019年

本文編號：2707863