發(fā)布時(shí)間：2020-05-31 03:49

【摘要】：背景炎癥反應(yīng)是機(jī)體對(duì)抗外來(lái)入侵物質(zhì)的一種反應(yīng)。在眼科領(lǐng)域,LPS誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(RPE)的炎癥與許多視網(wǎng)膜疾病的病理過(guò)程相關(guān),包括葡萄膜炎、年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)、糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)。地塞米松(DEX)是一種糖皮質(zhì)激素,具有很強(qiáng)的抗炎和免疫抑制作用,因此被廣泛用于治療眼部炎癥性疾病。但長(zhǎng)期運(yùn)用地塞米松會(huì)導(dǎo)致系統(tǒng)和局部的副作用,因此尋找新的治療視網(wǎng)膜炎癥的藥物靶點(diǎn)便成為研究熱點(diǎn)。近年來(lái),脂質(zhì)代謝平衡與炎癥的關(guān)系正成為新的研究熱點(diǎn)。我們及其他實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn),脂質(zhì)代謝關(guān)鍵受體肝臟X受體(LXRs)的外源性激動(dòng)劑TO901317可抑制視網(wǎng)膜炎癥并可能成為治療視網(wǎng)膜炎癥反應(yīng)的一類(lèi)新藥。然而有報(bào)道提示內(nèi)源性LXRs激動(dòng)劑7-酮基膽固醇(7-KC)卻能加重視網(wǎng)膜炎癥反應(yīng)。因此,我們提出疑問(wèn)7-KC和TO90都是LXRs的激動(dòng)劑,為什么兩者在炎癥調(diào)控方面卻起著截然相反的作用?基于以上研究背景,我們將實(shí)驗(yàn)分為兩個(gè)部分:1、驗(yàn)證7-KC和TO90對(duì)LPS誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞炎癥反應(yīng)具有相反作用,并采用RNA-seq和蛋白質(zhì)譜關(guān)聯(lián)分析研究其可能的機(jī)制。2、探討DEX在EIU小鼠模型中的作用及其機(jī)制。第一部分7-酮基膽固醇和TO901317在LPS誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用及其機(jī)制目的:肝臟x受體是調(diào)節(jié)脂質(zhì)平衡和炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn),外源性LXRs激動(dòng)劑TO901317具有抑炎作用,而內(nèi)源性的LXRs激動(dòng)劑7-KC卻起促炎作用。因此本實(shí)驗(yàn)旨在驗(yàn)證7-KC和TO90對(duì)LPS誘導(dǎo)的炎癥調(diào)控具有相反作用,并運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組和蛋白組學(xué)關(guān)聯(lián)分析探討其潛在機(jī)制。方法:不同濃度7-KC刺激人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞系(ARPE-19)24和36小時(shí)。然后用CCK-8和Annexin-V FITC/PI雙染色法檢測(cè)ARPE-19細(xì)胞的活性和凋亡。EdU檢測(cè)ARPE-19細(xì)胞的增殖。7-KC和TO90作用于ARPE-19細(xì)胞12小時(shí)后,再用5μg/mL的LPS刺激ARPE-19 細(xì)胞 24 小時(shí)。Real-time PCR 檢測(cè)炎癥因子 IL6、IL-8 和 LXRs及其靶基因ABCA1、ABCG1在mRNA水平的表達(dá)。Illumina Hiseq 2500平臺(tái)和Q Exactive質(zhì)譜儀用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和蛋白質(zhì)譜檢測(cè)。結(jié)果:高濃度7-KC明顯降低ARPE-19細(xì)胞活性并促進(jìn)凋亡。不同濃度7-KC作用ARPE-19細(xì)胞24和36小時(shí)后增殖水平無(wú)明顯變化。綜合細(xì)胞活性、凋亡和增殖的結(jié)果,最終選擇7.5μM的7-KC作為后續(xù)研究濃度。7-KC和TO90都能激活LXRs的靶基因ABCA1和ABCG1,但兩者對(duì)LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)卻存在相反作用。7-KC以濃度依賴(lài)的方式上調(diào)IL-6、IL-8、LXRα、LXRβ和ABCA1、ABCG1的表達(dá),而TO90卻抑制炎癥反應(yīng)。轉(zhuǎn)錄組分析提示7-KC激活了 Toll-樣受體和MAPK等信號(hào)通路,而TO90卻抑制這些通路。轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)7-KC不僅調(diào)控脂質(zhì)代謝,還激活Toll-樣受體、MAPK、mTOR、HIF-1和VEGF信號(hào)通路及炎癥相關(guān)基因,而TO90卻未直接調(diào)控這些炎癥通路和基因。結(jié)論:LXRs的內(nèi)源性和外源性激動(dòng)劑7-KC和TO90都激活其靶基因ABCA1和ABCG1,但TO90起抑制炎癥的作用,而7-KC卻起促炎作用。這種矛盾效應(yīng)可能與7-KC和TO90對(duì)Toll-樣受體、HIF-1、VEGF、mTOR和MAPK等炎癥信號(hào)通路和脂代謝相關(guān)基因的不同調(diào)控有關(guān)。第二部分DEX在內(nèi)毒素誘導(dǎo)性葡萄膜炎(EIU)中的作用及其機(jī)制的研究目的:探討地塞米松(DEX)對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)性葡萄膜炎(EIU)的作用及采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究其潛在的機(jī)制。方法:在BALB/c小鼠玻璃體腔內(nèi)注射125 ng內(nèi)毒素(LPS)誘導(dǎo)EIU小鼠模型,每隔4小時(shí)用0.1%DEX滴眼,共6次。采用裂隙燈觀察每個(gè)組小鼠眼前房炎癥并進(jìn)行臨床評(píng)分,HE染色觀察形態(tài)學(xué)改變。RNA測(cè)序(RNA-seq)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組的研究。Real-time PCR檢測(cè)炎癥因子在mRNA水平的表達(dá)及驗(yàn)證選中的差異表達(dá)基因。結(jié)果:DEX滴眼后顯著減輕了 EIU小鼠前房和后房的炎癥并降低IL-6、TNF-α、MCP-1 和 ICAM-1 在 mRNA 水平的表達(dá)。RNA-seq 共檢測(cè)出52個(gè)差異表達(dá)基因,與DEX+LPS組相比,在LPS組中上調(diào)的基因有37個(gè),下調(diào)的基因有15個(gè)。差異表達(dá)基因的功能分析未發(fā)現(xiàn)顯著富集的GO Terms,KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)有6個(gè)顯著上調(diào)和2個(gè)顯著下調(diào)的通路。KEGG結(jié)果提示DEX治療后可下調(diào)RIG-I類(lèi)受體信號(hào)通路(Ddx58、Ifih1、Isg15)及一些免疫炎癥相關(guān)基因(Ifit1、H2-T24、Mx2 和 Eif2ak2)。結(jié)論:DEX在LPS引起的EIU小鼠眼部炎癥中起保護(hù)作用,此保護(hù)作用可能與下調(diào)RIG-I類(lèi)受體信號(hào)通路及一些免疫炎癥相關(guān)基因有關(guān)。
【圖文】：

邐Ｍｅｒｇｅ逡逑ＩＯＢ９ＩＢＨＢ邋ＢＫＢ逡逑圖１．１邋ＡＲＰＥ－１９細(xì)胞的ＲＰＥ特異性抗體ＲＰＥ－６５的染色鑒定？（放大倍數(shù)ｘ４００）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．１邋Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＡＲＰＥ－１９邋ｃｅｌｌｓ邋ｗｉｔｈ邋ＲＰＥ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ邋ＲＰＥ６５邋ａｎｔｉｂｏｄｙ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ．邋（Ｔｈｅ逡逑ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｘ４００）逡逑２．２不同濃度的７－ＫＣ對(duì)ＡＲＰＥ－１９細(xì)胞活性的影響逡逑為了探討不同濃度７－ＫＣ對(duì)ＡＲＰＥ－１９細(xì)胞活性的影響，我們采用ＣＣＫ－８試劑逡逑盒檢測(cè)不同濃度７－ＫＣ刺激ＡＲＰＥ－１９細(xì)胞２４和３６小時(shí)后細(xì)胞的活性。我們發(fā)現(xiàn)逡逑當(dāng)７－ＫＣ濃度小于５邋ｊｉＭ的時(shí)候，刺激２４和３６小時(shí)后ＡＲＰＥ－１９細(xì)胞活性增強(qiáng)。另逡逑外，當(dāng)７－ＫＣ刺激２４小時(shí)，大于１０邋ｐＭ的７－ＫＣ濃度可顯著降低ＡＲＰＥ－１９細(xì)胞的逡逑活性；當(dāng)７－ＫＣ刺激３６小時(shí)，大于７．５邋ｐＭ的７－ＫＣ濃度便可顯著降低ＡＲＰＥ－１９細(xì)逡逑胞的活性（圖１．２）。逡逑２４邋ｈｏｕｒｓ邐３６邋ｈｏｕｒｓ逡逑２００－１邐１５０－１逡逑＊＊＊＊＊＊逡逑ｍＳＬｍ邋＿ＺＣ＿邋＊逡逑ｔ１５０－邋ａ邋ｔ＾－ｎｎ邋ｎ逡逑Ｂｉ00－ｎｎｆ｜邐１邐｜逡逑＞邐Ｉ邐＞邋５０－邐Ｉｔ逡逑＝５０－邐Ｉ邐＝邐｜逡逑＜３邐■基＊＊＊＊＊＊邋ｇ邐＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊逡逑７－ＫＣ邐７－ＫＣ逡逑圖１．２不同濃度７－ＫＣ刺漱ＡＲＰＥ－１９細(xì)胞２４和３６小時(shí)后細(xì)胞的活性（＊ｐ＜０．０５，，邋＊＊ｐ＜０．０１，逡逑＊＊＊ｐ＜０．００１

２．１不同濃度的ＴＯ９０對(duì)ＡＲＰＥ－１９細(xì)胞活性的影響逡逑我們選用（０，邋０．１，１，５，邋１０，邋１００）邋ｐＭ的ＴＯ９０刺激ＡＲＰＥ－１９細(xì)胞２４和３６小時(shí)。逡逑結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ＴＯ９０對(duì)ＡＲＰＥ－１９細(xì)胞的活性無(wú)明顯影響（圖１．６）。根據(jù)以前的文獻(xiàn)逡逑經(jīng)驗(yàn)，我們選擇�。偷模裕希梗白鳛楹罄m(xù)研究的濃度。逡逑２４邋ｈｏｕｒｓ邐３６邋ｈｏｕｒｓ逡逑ｇ，邐？邐＾逡逑ｌ＾ｎｎｉｌｉａｌ邋ｌ１＇°Ｔｉｎｎｉａｉａ逡逑ＩＩＩ邋１邋Ｉ邋ｓ邋ＩＩＩ逡逑0＿0邋丨丨邋ｉ邋丨丨邋１１邋１１１邋１１１邐0．0邋ＩＩ邋！邋Ｉ邋１邋１１１邋■邋１１！邋Ｉ邐ｏ．ｏ邋丨丨■丨丨邋ｉ邋丨邋Ｉ邋丨邋１１１１逡逑夕邐＜ｓ＾邐＜ｆ逡逑ＴＯ９０（ｎＭ）邐ＴＯ９０（ｎＭ）邐ＴＯ９０（ｎＭ）＋ＬＰＳ（５＾ｇ／ｍｌ）逡逑圖１．６不同濃度的ＴＯ９０對(duì)ＡＲＰＥ－１９細(xì)胞活性的影響（１１＝５邋）？逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．６邋Ｃｅｌｌ邋ｖｉａｂｉｌｉｔｙ邋ｏｆ邋ＡＲＰＥ－１９邋ｃｅｌｌｓ邋ｃｕｌｔｕｒｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ＴＯ９０邋ｆｏｒ邋２４邋ａｎｄ邋３６邋ｈｏｕｒｓ邋（ｎ＝５）．逡逑２．２ＴＯ９０作用時(shí)間的選擇逡逑為了找到ＴＯ９０的最佳作用時(shí)間，我們分別提前３、６、１２小時(shí)加入ＴＯ９０預(yù)逡逑處理ＡＲＰＥ－１９細(xì)胞，然后加入５邋ｐｇ／ｍｌ的ＬＰＳ刺激２４小時(shí)。結(jié)果顯示提前１２小逡逑時(shí)加ＴＯ９０可顯著降低炎癥因子ＩＬ－６和ＩＬ－８在ｍＲＮＡ水平的表達(dá)，而提前３、６逡逑小時(shí)加ＴＯ９０均不能抑制ＬＰＳ誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)（圖１．７）。因此
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R774.1

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 徐靜;胡報(bào);王建春;;肝臟X受體與炎癥反應(yīng)[J];重慶醫(yī)學(xué);2010年21期

2 顧文娟;李江;;肝臟X受體研究在心血管疾病中的應(yīng)用展望[J];醫(yī)學(xué)與哲學(xué)(臨床決策論壇版);2010年01期

3 王強(qiáng);江渝;;肝X受體的研究進(jìn)展[J];生理科學(xué)進(jìn)展;2009年02期

4 錢(qián)一欣;倪兆慧;;肝X受體在代謝和炎癥中的作用[J];臨床心血管病雜志;2007年11期

本文編號(hào)：2689236