【摘要】：目的:探討WWOX基因在鼻咽癌細胞中的生物學(xué)功能及其分子機制。方法:1.設(shè)計并包裝含WWOX基因片段和空載片段的慢病毒載體。分別將攜有WWOX基因片段和空載片段的慢病毒載體通過體外基因轉(zhuǎn)染鼻咽癌細胞株CNE1構(gòu)建實驗組CNE1/WWOX和空載組CNE1/CON,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后的細胞進行擴增培養(yǎng)。其中以轉(zhuǎn)染空載片段的慢病毒載體(空載組CNE1/CON)及未經(jīng)轉(zhuǎn)染(空白對照組CNE1)的細胞作為對照。在轉(zhuǎn)染72h后,在倒置熒光顯微鏡下進行觀察、拍照并計算轉(zhuǎn)染效率。借助于實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)和蛋白免疫印跡法(Western Blot,WB)分別測定三組細胞中WWOX的mRNA和WWOX蛋白的表達。2.分別用劃痕實驗和/或Transwell遷移實驗以及Transwell侵襲實驗研究WWOX過表達對三組細胞遷移及侵襲能力的影響。用RT-PCR檢測三組細胞中E-cadherin的mRNA的表達。3.通過平板克隆形成實驗、四甲基偶氮唑藍(MTT)比色法來檢測三組細胞的生長、增殖能力。用流式細胞儀來檢測三組細胞周期的變化及用Annexin V-APC/7-AAD雙熒光標記細胞凋亡實驗來分別檢測三組細胞的細胞凋亡的變化。用Western Blot檢測AKT、p-AKT、Caspase-3、CleavedCaspase-3蛋白表達。結(jié)果:1.CNE1/CON和CNE1/WWOX的轉(zhuǎn)染效率分別為96.7±0.7%、95.8±1.0%。RT-PCR實驗結(jié)果顯示,CNE1、CNE1/CON和CNE1/WWOX中WWOX的mRNA相對表達量分別為1.000±0.001、1.010±0.041和104.691±0.418,實驗組較空載組和空白對照組WWOX的mRNA相對表達量明顯增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。Western blot檢測結(jié)果顯示CNE1、CNE1/CON和CNE1/WWOX中WWOX蛋白相對表達量分別為0.151±0.042,0.139±0.10和1.263±0.195,實驗組較空載組和空白對照組WWOX的蛋白相對表達量明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。2.劃痕實驗結(jié)果顯示,CNE1、CNE1/CON和CNE1/WWOX相對劃痕愈合率分別為(55.67±2.08)%、(58.67±1.15)%和(11.67±1.15)%,實驗組較空載組和空白對照組相對劃痕愈合率明顯減小,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。Transwell遷移實驗結(jié)果顯示,CNE1、CNE1/CON和CNE1/WWOX細胞穿膜數(shù)分別為206.8±3.7個,201.4±3.1個和58.8±3.0個,實驗組較空載組和空白對照組的細胞穿膜數(shù)明顯下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示CNE1、CNE1/CON和CNE1/WWOX中細胞穿膜數(shù)分別為114.2±8.7個,109.0±5.9個,31.0±2.2個,實驗組較空載組和空白對照組的細胞穿膜數(shù)明顯下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。RT-PCR檢測三組細胞E-cadherin的mRNA表達情況。結(jié)果顯示CNE1、CNE1/CON和CNE1/WWOX中E-cadherin的mRNA相對表達量分別為1.000±0.000、1.009±0.015和1.393±0.080,實驗組較空載組和空白對照組E-cadherin的mRNA相對表達量增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3.細胞克隆形成實驗顯示,CNE1、CNE1/CON和CNE1/WWOX中細胞克隆形成率分別為(71.9±3.4)%、(70.1%±2.3)%和(27.9%±1.7)%,實驗組細胞生長速度較慢,形成的克隆較小,且其克隆形成率明顯少于空載組和空白對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。MTT實驗結(jié)果顯示,實驗當天三組細胞OD值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),從第24h開始,實驗組OD值明顯低于空載組和空白對照組的各時間點,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。用流式細胞儀檢測細胞周期,實驗結(jié)果顯示CNE1、CNE1/CON和CNE1/WWOX中G0/G1期的細胞數(shù)分別為(62.31±1.26)%、(59.60±1.87)%和(40.95±2.29)%;CNE1、CNE1/CON和CNE1/WWOX中G2/M期的細胞數(shù)分別為(8.38±0.23)%、(8.88±0.87)%和(22.06±1.34)%;CNE1、CNE1/CON和CNE1/WWOX中S期的細胞數(shù)分別為(29.30±1.48)%、(31.52±1.28)%和(36.99±1.78)%,實驗組較空載組和空白對照組G0/G1期的細胞數(shù)明顯下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),實驗組較空載組和空白對照組G2/M期的細胞數(shù)明顯增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),而S期在三組細胞中變化不大,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3.用Annexin V-APC/7-AAD雙染料處理細胞,用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。實驗結(jié)果顯示CNE1、CNE1/CON、CNE1/WWOX細胞凋亡率分別為(4.13±0.10)%、(4.15±0.04)%和(16.54±0.07)%,實驗組較空載組和空白對照組的細胞凋亡率明顯增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。Western blot檢測AKT、p-AKT蛋白和Caspase3、cleaved-Caspase3蛋白表達水平。實驗結(jié)果顯示,CNE1、CNE1/CON和CNE1/WWOX中p-AKT蛋白相對表達量分別為0.842±0.009,0.843±0.010和0.604±0.006,實驗組較空載組和空白對照組的p-AKT蛋白相對表達量降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);然而,三組細胞中AKT的蛋白相對表達量變化不大,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。CNE1、CNE1/CON和CNE1/WWOX中Caspase3蛋白相對表達量分別為0.548±0.10,0.546±0.008和0.147±0.06,實驗組較空載組和空白對照組Caspase3的蛋白相對表達量降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。然而,三組細胞中的cleaved-Caspase3蛋白相對表達量分別為0.285±0.008,0.287±0.007和0.533±0.004,實驗組較空載組和空白對照組cleaved-Caspase3蛋白相對表達量增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1.成功構(gòu)建WWOX過表達穩(wěn)定的實驗組CNE1/WWOX細胞株和空載組CNE1/CON細胞株。2.WWOX過表達可使E-cadherin表達上調(diào),抑制鼻咽癌細胞的遷移和侵襲能力。3.WWOX過表達可明顯抑制鼻咽癌細胞生長、增殖能力。WWOX過表達可能是通過誘導(dǎo)細胞周期阻滯在G2/M期,從而抑制鼻咽癌細胞增殖。WWOX過表達可能通過激活A(yù)KT使p-AKT(Ser473)的蛋白表達水平下調(diào)或/和通過激活caspase-3,使cleaved-Caspase3蛋白表達水平上調(diào),從而促進鼻咽癌細胞CNE1的細胞凋亡。
【圖文】：

圖 1-2 RT-PCR 檢測三組細胞中 WWOX 的 mRNA 表達情況 The mRNA expression of WWOX in three groups of cells was detected by RT-PCR. **P<0.01; ***P<0.001）印跡（Western blot）檢測WWOX蛋白表達水平的變化慢病毒轉(zhuǎn)染后，，Western blot結(jié)果顯示 CNE1、CNE1/CON和WOX中WWOX蛋白相對表達量分別為0.151 ± 0.042，0.13 ± 0.195。實驗組較空載組和空白對照組中WWOX蛋白表達水 <0.05)，見圖1-3。從蛋白水平說明細胞轉(zhuǎn)染后，成功構(gòu)建穩(wěn)定細胞株。

圖2-1 WWOX對鼻咽癌細胞CNE1相對愈合能力的影響（×200）e 2-1. Effect ofWWOX on the relative healing ability of nasopharyngeal carcinoma cell CNE1. （*P<0.05;**P<0.01; ***P<0.001）（×200）WWOX基因后鼻咽癌CNE1細胞遷移能力的變化ranswell遷移實驗結(jié)果顯示CNE1、CNE1/CON和CNE1/WWOX中細胞分別為206.8±3.7個、 201.4±3.1個和58.8±3.0個。實驗組的細數(shù)較空載組和空白對照組明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),如Transwell遷移實驗與劃痕實驗的結(jié)果相一致，進一步說明WWOX基達可明顯抑制鼻咽癌CNE1細胞的遷移能力。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R739.63

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本文編號：2664887