【摘要】：目的:研究白介素-1(interleukin-1β,IL-1β)在角膜移植免疫排斥反應(yīng)中的作用,進(jìn)一步探討IL-1β參與角膜移植免疫排斥反應(yīng)的機(jī)制。方法:(1)構(gòu)建小鼠穿透性角膜移植模型,并隨機(jī)分為正常對(duì)照組、同系移植組、異系移植組、異系移植并IL-1β中和性抗體處理組。在此基礎(chǔ)上,通過(guò)裂隙燈觀察IL-lβ中和性抗體對(duì)角膜移植免疫排斥反應(yīng)的影響;并利用Real-time PCR和Western blot檢測(cè)各組小鼠角膜植片中IL-lβ及其受體IL-1R1等的表達(dá)水平;免疫熒光分析IL-lβ受體IL-1R1的表達(dá)水平及其分布情況。(2)分別利用野生型小鼠和NLRP3缺陷小鼠構(gòu)建穿透性角膜移植模型,并隨機(jī)分為正常對(duì)照組、同系移植組和異系移植組。在此基礎(chǔ)上,通過(guò)臨床觀察研究干預(yù)NLRP3炎癥小體抑制IL-lβ成熟對(duì)角膜抑制免疫排斥反應(yīng)的影響;并進(jìn)一步利用Western Blot和免疫熒光技術(shù)分析角膜移植免疫排斥過(guò)程中NLRP3和IL-1β表達(dá)水平的變化;使用酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)角膜植片中白介素-17(Interleukin-17,IL-17)和干擾素-γ(Interferon-γ,IFN-γ)的含量。此外,我們還利用NLRP3炎癥小體抑制劑Glubide驗(yàn)證阻斷NLRP3炎癥小體活化對(duì)角膜移植免疫排斥反應(yīng)的影響。(3)體外無(wú)菌分離小鼠骨髓,通過(guò)巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Macrophage-colony stimulating factor,M-SCF)誘導(dǎo)骨髓源巨 噬細(xì)胞(Bone marrow derived macrophages,BMDMs)在此基礎(chǔ)上,行脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)和三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)刺激,并通過(guò)Western Blot分析不同組別內(nèi)巨噬細(xì)胞中IL-1β表達(dá)水平的變化,ELISA檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1β的含量。(4)無(wú)菌分離脾細(xì)胞,并將其分成空白對(duì)照組、IL-6+TGFβl處理組以及IL-6+TGFβl+IL-1β 處理組;同時(shí)利用 Anti-CD3(15μg/ml)和 anti-CD28(5μg/ml)刺激96h,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同組別細(xì)胞中Th17細(xì)胞的相對(duì)含量,并采用FLLSA檢測(cè)不同組別細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-17的含量。(5)構(gòu)建小鼠穿透性角膜移植模型,隨機(jī)分為異系移植組、異系移植并IL-17抗體治療組。在此基礎(chǔ)上,通過(guò)臨床觀察評(píng)估IL-17中和性抗體對(duì)角膜移植免疫排斥反應(yīng)的影響;通過(guò)蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining,HE)評(píng)估不同組別角膜植片的病理改變。結(jié)果:(1)與同系移植組相比較,異系移植組小鼠角膜植片中的IL-1β mRNA水平明顯著增加;Western blot結(jié)果顯示:活化形式的IL-1β在異系移植組中的水平明顯高于同系移植組。同時(shí),IL-1β受體IL-1R1的表達(dá)水平在角膜免疫排斥過(guò)程中也顯著增強(qiáng),且廣泛表達(dá)于發(fā)生免疫排斥小鼠角膜植片的上皮層、基質(zhì)層和內(nèi)皮層。IL-1β中和實(shí)驗(yàn)表明IL-1β中和性抗體可顯著延長(zhǎng)角膜植片的存活時(shí)間。以上結(jié)果提示IL-1β可促進(jìn)角膜移植免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生。(2)Western blot結(jié)果表明,發(fā)生免疫排斥反應(yīng)的小鼠角膜植片中NLRP3的表達(dá)水平顯著增加,且主要表達(dá)于角膜植片的上皮層、基質(zhì)層以及內(nèi)皮層。與對(duì)照組相比,利用Glubide抑制NLRP3炎癥小體的活性可明顯延長(zhǎng)角膜植片的存活時(shí)間,并有效減輕角膜移植排斥反應(yīng)。與野生型小鼠模型比較,NLRP3缺陷小鼠角膜植片存活時(shí)間明顯延長(zhǎng);但向NLRP3缺陷小鼠回輸IL-1β則可明顯促進(jìn)角膜移植免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生。通過(guò)ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn),NLRP3缺陷小鼠角膜植片中IL-17的水平顯著降低,而IFN-γ的水平則沒(méi)有顯著變化,提示NLRP3炎癥小體可能通過(guò)影響Th17細(xì)胞免疫反應(yīng)參與角膜移植免疫排斥反應(yīng)。(3)通過(guò)BMDM模型發(fā)現(xiàn),與野生型BMDM比較,NLRP3缺陷的BMDM分泌IL-1β的能力顯著下降。通過(guò)體外共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與野生型BMDM培養(yǎng)上清處理組相比較,NLRP3缺陷BMDM培養(yǎng)上清刺激Th17細(xì)胞分化的能力顯著下降;ELISA的結(jié)果顯示,NLRP3缺陷BMDM培養(yǎng)上清誘導(dǎo)產(chǎn)生的Th17細(xì)胞分泌IL-17的能力也明顯下降。上述結(jié)果表明IL-1β可促進(jìn)Th17細(xì)胞免疫反應(yīng)。(4)與對(duì)照組相比,IL-17中和性抗體可明顯延長(zhǎng)角膜植片存活時(shí)間;病理分析結(jié)果顯示:IL-17中和性抗體可有效抑制角膜植片炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。上述結(jié)果表明Th17細(xì)胞免疫反應(yīng)參與角膜移植免疫排斥的病理過(guò)程。結(jié)論:(1)角膜移植免疫排斥過(guò)程中,角膜植片中IL-1β的表達(dá)水平顯著增強(qiáng),中和IL-1β可延長(zhǎng)角膜植片存活時(shí)間。(2)角膜移植免疫排斥過(guò)程中,角膜植片中的NLRP3表達(dá)水平明升高,通過(guò)干預(yù)NLRP3炎癥小體抑制IL-1β的成熟可有效抑制角膜移植免疫排斥反應(yīng)。(3)IL-1β通過(guò)誘導(dǎo)Th17細(xì)胞參與角膜移植免疫排斥反應(yīng),中和IL-17可延長(zhǎng)角膜植片存活時(shí)間。
【圖文】：

圖１ＩＬ－１Ｐ對(duì)小鼠角膜移植免疫排斥反應(yīng)的影響＆邋（Ａ）三姐小鼠角膜移植術(shù)后ＩＬ－ｉｐ前體逡逑ＰＣＲ結(jié)果；（Ｂ）邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ檢測(cè)邑組小鼠植片ＩＬ－ｉｐ前體、成熟體及其受體的表達(dá)情逡逑況；（Ｃ）免疫熒光檢測(cè)三．}D小鼠植片ＩＬ－１Ｐ受體分布情況；ＣＤ）三組小鼠角膜移楦術(shù)逡逑后植．片存活曲線，采用Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅ＿ｒ生，存分析ｄ逡逑

３巨噬細(xì)胞通過(guò)ＩＬ－ｌｐ誘導(dǎo)Ｔｈｌ７細(xì)胞分化６邋（Ａ）邋ＥＬＩＳＡ檢測(cè)巨噬細(xì)胞上猜中ＩＬ－ｉｐ的逡逑]裕沖危ǎ攏╁澹祝澹螅簦澹潁鑠澹攏歟錚艏?xì)e翰獠患緙壕蓿菏上赴蠇p內(nèi)的ＩＬ－１（３的表，達(dá)愉況；（Ｃ）流式術(shù)不同培養(yǎng)上＿誘導(dǎo)Ｔｈｌ７細(xì)胞的Ｗ分比；（Ｄ邋）邋ＥＬＩＳＡ檢測(cè)不：同組別Ｔｈｌ７細(xì)胞分泌ＩＬ的含]質(zhì)灣義，

本文編號(hào)：2661018