發(fā)布時(shí)間：2020-03-26 07:07

【摘要】：前言:喉癌是常見的惡性腫瘤之一,其中以鱗狀細(xì)胞癌最常見。喉癌的病因復(fù)雜,與吸煙、飲酒、暴露于有害的塵埃有關(guān)。盡管手術(shù)、化療、放療和免疫治療等多種治療技術(shù)不斷進(jìn)步,但在過去的10年中患者的5年總生存率并沒有明顯改善。因此,尋找喉癌初期診斷與個(gè)體化治療的新型分子標(biāo)志物是目前研究的熱點(diǎn)。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類長18~24個(gè)核苷酸的非編碼小RNA,具有重要的分子生物學(xué)功能。研究發(fā)現(xiàn),miRNA參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的存活、自噬、增殖、凋亡以及遷移等重要生命過程。miRNA存在于人體多種體液中,在多種人類腫瘤中表達(dá)異常,參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展,是目前極具價(jià)值的包括腫瘤在內(nèi)的分子標(biāo)志物。miR-181a是miR-181家族成員之一,可通過調(diào)控多種靶基因的表達(dá),影響腫瘤細(xì)胞的增殖、粘附、侵襲和分化。研究證實(shí),miR-181a在膠質(zhì)瘤、宮頸癌、肺癌和乳腺癌中發(fā)揮“抑癌基因”作用,而在肝癌和胃癌中發(fā)揮“癌基因”作用。目前,miR-181a在喉癌中相關(guān)研究未見報(bào)道。通過MiRanda等軟件預(yù)測(cè),我們發(fā)現(xiàn)NPM1是miR-181a潛在靶標(biāo)之一。近年來,對(duì)NPM1的研究主要集中在其與血液系統(tǒng)腫瘤的關(guān)系。此外,NPM1在包括前列腺癌、肝癌、肺癌等一些實(shí)體腫瘤中高表達(dá),提示其在腫瘤中發(fā)揮癌基因作用。然而,NPM1在喉癌中相關(guān)研究亦未見報(bào)道。本研究應(yīng)用相關(guān)分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)了miR-181a和NPM1在喉癌中的表達(dá)水平,鑒定了miR-181a的靶基因NPM1,并檢測(cè)了二者在喉癌中分子生物學(xué)功能,為進(jìn)一步探討miR-181a在喉癌中的分子作用機(jī)制和作為喉癌分子標(biāo)志物的可能性奠定了基礎(chǔ)。材料與方法:1、細(xì)胞系和組織標(biāo)本:人喉癌細(xì)胞系Hep2、人胚腎細(xì)胞系HEK293T、喉癌組織標(biāo)本。2、實(shí)驗(yàn)方法:細(xì)胞培養(yǎng)、基因片段轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)、qRT-PCR實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞儀檢測(cè)、CCK8實(shí)驗(yàn)和克隆形成檢測(cè)、熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)、SPSS統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果:1、qRT-PCR結(jié)果顯示,與癌旁正常組織和HEK293T細(xì)胞相比,miR-181a在喉癌組織和Hep2細(xì)胞中表達(dá)水平顯著降低(P0.05),NPM1在喉癌組織和Hep2細(xì)胞中表達(dá)水顯著增高(P0.05),二者轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.4185,P0.01)。Western blot結(jié)果顯示,與癌旁正常組織和相比,NPM1在喉癌組織中蛋白表達(dá)水平顯著增高(P0.05)。上述結(jié)果提示miR-181a和NPM1在喉癌中分別發(fā)揮潛在抑癌基因和癌基因作用。2、熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示,在Hep2細(xì)胞系中,LutNPM1-Wt+mi R-181a mimic共轉(zhuǎn)染組報(bào)告基因活性較對(duì)照組顯著下降(P0.05)。Real-time PCR和Western blot結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-181a mimic或mi R-181a inhibitor后48h,與對(duì)照組相比,Hep2細(xì)胞中NPM1 mRNA和蛋白表達(dá)水平分別顯著降低和增高(P0.05)。上述結(jié)果提示NPM1是miR-181a的靶基因。3、CCK8和克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,miR-181a mimic轉(zhuǎn)染組中Hep2細(xì)胞的增殖及克隆形成能力顯著降低(P0.05),miR-181a inhibitor轉(zhuǎn)染組中Hep2細(xì)胞增殖及克隆形成能力顯著增高(P0.05),提示miR-181a抑制Hep2細(xì)胞的增殖。4、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染miR-181a mimic或miR-181a inhibitor后48h,Hep2細(xì)胞的早期凋亡比例較對(duì)照組分別顯著升高或降低(P0.05),提示miR-181a促進(jìn)Hep2細(xì)胞的凋亡。5、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)周期結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染miR-181a mimic后48h,與對(duì)照組相比,位于S期的細(xì)胞比例顯著增加(P0.05),而位于G0/G1期和G2/M期的細(xì)胞比例則顯著減少(P0.05),提示miR-181a通過誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生S期阻滯,進(jìn)而抑制喉癌細(xì)胞的增殖。6、CCK8和克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,過表達(dá)NPM1轉(zhuǎn)染組中Hep2細(xì)胞增殖能力及克隆形成數(shù)目顯著升高(P0.05),si-NPM1轉(zhuǎn)染組中Hep2細(xì)胞增殖能力及克隆形成數(shù)目顯著降低(P0.05),提示NPM1促進(jìn)Hep2細(xì)胞的增殖。7、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡結(jié)果表明,si-NPM1轉(zhuǎn)染組中Hep2細(xì)胞早期凋亡比例較對(duì)照組顯著升高(P0.05),過表達(dá)NPM1組中Hep2細(xì)胞早期凋亡比例與對(duì)照組相比無明顯差異(P0.05),提示敲減NPM1可促進(jìn)Hep2細(xì)胞早期凋亡。8、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)周期結(jié)果表明,si-NPM1和NPM1轉(zhuǎn)染后48h,與對(duì)照組相比,位于G0/G1期的細(xì)胞比例分別顯著增加和減少(P0.05);位于S及G2/M期的細(xì)胞比例分別顯著減少和增加(P0.05),提示NPM1通過誘導(dǎo)細(xì)胞由G0/G1期向S期的演進(jìn),進(jìn)而促進(jìn)喉癌細(xì)胞的增殖。結(jié)論:1、miR-181a和NPM1在喉癌中分別下調(diào)和上調(diào),二者在轉(zhuǎn)錄水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,提示二者在喉癌中分別發(fā)揮抑癌基因和癌基因作用。2、NPM1是mi R-181a直接靶基因。3、miR-181a和NPM1分別抑制和促進(jìn)喉癌細(xì)胞增殖,其中前者通過S期阻滯抑制喉癌細(xì)胞增殖,而后者通過誘導(dǎo)G0/G1期向S期的演進(jìn)促進(jìn)喉癌細(xì)胞增殖。4、mi R-181a和NPM1分別促進(jìn)和抑制喉癌細(xì)胞早期凋亡,而且,NPM1回復(fù)mi R-181a對(duì)喉癌細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用,提示mi R-181a通過抑制NPM1促進(jìn)喉癌細(xì)胞凋亡。
【圖文】：

中國醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文3 結(jié)果3.1 miR-181a 在喉癌組織和喉癌 Hep2 細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)應(yīng)用 qRT-PCR 檢測(cè) miR-181a 在 47 例喉癌組織及相應(yīng)癌旁組織表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在 47 例標(biāo)本中，miR-181a 在 40 例（85%）喉癌組織中表達(dá)水平低于癌旁組織（圖 1A）；統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果表明，miR-181a 在 47 例喉癌組織中平均表達(dá)量顯著低于癌旁組織（圖 1B，P<0.05）；應(yīng)用 qRT-PCR 檢測(cè) miR-181a 在喉癌 Hep2 細(xì)胞、人胚腎 HEK293T 細(xì)胞中表達(dá)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示 miR-181a 在 Hep2 細(xì)胞中內(nèi)源性表達(dá)水平顯著低于 HEK-293T 細(xì)胞（圖 1C，P<0.001）。

中國醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文3.2 NPM1 在喉癌組織和喉癌 Hep2 細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)選取 45 對(duì)新鮮喉癌組織及相應(yīng)癌旁組織，，應(yīng)用 qRT-PCR 檢測(cè) NPM1 mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，NPM1 在 39 例（87%）喉癌組織中表達(dá)高于癌旁組織（圖2.1A）；統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果表明 NPM1 在 45 例喉癌組織中平均表達(dá)量顯著高于癌旁組織(圖2.1B，P<0.001)；應(yīng)用 qRT-PCR 檢測(cè) NPM1 在喉癌 Hep2 細(xì)胞、人胚腎 HEK293T細(xì)胞中表達(dá)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果提示 NPM1 在喉癌 Hep2 細(xì)胞中內(nèi)源性表達(dá)水平顯著高于HEK-293T 細(xì)胞（圖 2.1C，P<0.05）；相關(guān)分析結(jié)果顯示喉癌組織中 miR-181a mRNA表達(dá)水平與 NPM1 mRNA 表達(dá)水平呈顯著負(fù)性相關(guān) r=-0.4185（圖 2.1D，P<0.01），進(jìn)一步說明 miR-181a 與 NPM1 存在調(diào)控關(guān)系。同時(shí)，我們應(yīng)用 Western blotting 檢測(cè)了 NPM1 在 32 對(duì)喉癌組織及相應(yīng)癌旁組織中的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果所示在喉癌組織中 NPM1 蛋白平均表達(dá)量顯著高于癌旁組織（圖 2.2，P<0.001）。
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R739.65

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本文編號(hào)：2601133