【摘要】： 背景 熱休克轉錄因子4(heat shock transcription factor 4,Hsf4)被認為是一種新的與白內障發(fā)生相關基因,在Hsf4 DNA結合域或其它調節(jié)域的錯義突變與人先天性或家族常染色體顯性或隱性遺傳性白內障密切相關,這些基因突變與動物先天性白內障發(fā)生也密切相關,小鼠模型中Hsf4基因缺失可妨礙晶狀體上皮細胞增殖和纖維細胞終未分化,從而導致出生后晶狀體核白內障。 Hsf4有Hsf4a、Hsf4b兩種亞型,Hsf4b是調節(jié)鼠晶狀體發(fā)育中唯一亞型,已報道Hsf4b基因缺失不僅可以下調許多熱休克蛋白(例如:Hsp25γ-晶體蛋白,β-晶體蛋白和骨骼肌蛋白)的表達,而且可以上調鼠晶狀體組織中許多基因的表達(例如:FGF家族成員),這些研究表明Hsf4b通過對其下游靶基因轉錄激活和轉錄抑制雙重作用而調控晶狀體發(fā)育,但是,調節(jié)Hsf4b轉錄活性的信號通路還不清楚。 目的 探討Hsf4調控晶狀體發(fā)育的分子機制。通過探究Hsf4在上述信號轉導通路中的作用,揭示Hsf4基因突變所致先天性白內障的致病機理,為早期診斷和治療Hsf4突變相關的先天性白內障提供理論依據。 方法 用人心臟cDNA文庫為模板,應用囊括Hsf4b全長的引物進行PCR并在Hsf4bcDNA的N-端加入Flag標簽。將PCR產物經Kpn I和EcoR I酶切后,與該二酶線性化pcDNA3.0質粒一起連接獲得重組質粒pcDNA-Flag-Hsf4b,將克隆好的pcDNA-flag-Hsf4b轉染HEK293T細胞,并用抗Flag抗體進行免疫印跡分析,免疫沉淀實驗和體內Pull down實驗證明Hsf4b可與MAP激酶P38結合,激酶實驗結果顯示P38可體外磷酸化Hsf4b。 用Hsf4-/-小鼠的晶狀體上皮細胞轉染SV40,T-抗原,G418篩選建立永生化細胞系MLEC/Hsf4-/-。應用不同的含有CMV啟動子的質粒(如腺病毒載體),在mLEC細胞和其他細胞系中表達Hsf4b,測定Hsf4b對CMV啟動子的抑制作用。DNA-蛋白沉淀實驗和DNA-蛋白結合實驗體外測定Hsf4b與CMV啟動子的結合。免疫印跡檢測Hsf4b/S299磷酸化抑制Hsf4b的轉錄活性,免疫沉淀和細胞內GST pull down實驗證明Hsf4蛋白可以結合轉錄抑制調節(jié)因子Daxx,免疫熒光染色實驗發(fā)現Hsf4b被摹集到核內Daxx的POD核小體內。 結果 成功構建熱休克轉錄因子4b (Hsf4b)的真核表達載體并在真核細胞HEK293T中表達,研究發(fā)現Hsf4b可與MAP激酶P38結合,Hsf4b的C-端轉錄調控區(qū)參與和P38的結合, P38可體外磷酸化Hsf4b。 Hsf4b具有轉錄抑制功能,Hsf4b可與CMV啟動子中176bp處TTC(HSE序列)的序列直接結合,抑制CMV啟動子活性,把此序列中TTC突變?yōu)镚CC可抑制Hsf4b對CMV活性的負性調節(jié)作用。Hsf4b轉錄抑制功能通過與轉錄抑制調節(jié)因子Daxx結合實現,Hsf4b被摹集到核內Daxx的POD核小體內,Hsf4b與Daxx的結合受Hsf4b/S299磷酸化調控。 結論 實驗首次證明Hsf4b與P38結合而被磷酸化,并且發(fā)現Hsf4b具有轉錄抑制功能,Hsf4b/S299磷酸化可調控Hsf4b與Daxx結合從而調控Hsf4b轉錄抑制活性。為進一步探討Hsf4b在晶狀體發(fā)育過程中的作用提供了新的信號通路。
【圖文】：

15圖1 重組質粒pCDNA3-flag-hsf4b 的酶切鑒定Fig 1 Identification of pCDNA3-flag-hsf4b by enzyme digestion1: DNA Marker; 2: pCDNA3-flag-hsf4b; 3and4:pCDNA3-flag-hsf4b / EcoR I and Kpn11.4.2 Hsf4b 在 HEK 293T 細胞中的表達我們將克隆好的pcDNA-flag-Hsf4b 轉染HEK 293T細胞，并用抗Flag抗體進行免疫印跡分析。結果顯示，，轉染pcDNA-Flag-Hsf4b 質粒的細胞 在60KD處表達兩條Hsf4b帶（圖2,泳道2),上面條帶為磷酸化Hsf4b[12]，下面條帶為Hsf4b; 而轉染pcDNA3.0空質粒的HEK293細胞則沒出現新的蛋白條帶( 圖2, 泳道1) , 說明重組表達質�？梢栽谡婧思毎杏行П磉_。

圖2 pCDNA3-flag-hsf4b 轉染HEK293T 細胞表達的Wes tern blot 分析Fig2 Expression of pCDNA3-flag-hsf4b detected by Western blot1.4.3 Hsf4b 結合 MAP 激酶 P38已有報道， Hsf4 受磷酸化調控，Hsf4b 可結合MAP 激酶 Erk1/體外磷酸化[12]。為進一步探討Hsf4b 是否受其他MAP激酶家族成員的了免疫沉淀試驗。將pcDNA3 空質粒和pcDNA-Flag-Hsf4b 分別轉入H中，用抗Flag 抗體作免疫沉淀。結果發(fā)現Hsf4b 可與細胞內源的p3起免疫共沉淀（圖3，泳道 2 ）。而轉染空質粒則不能沉淀P38蛋白（圖3上部第三泳道為細胞裂解液中內源P38 的表達， 用于陽性對照。疫沉淀的Hsf4b 蛋白。結果說明Flag-Hsf4b和P38可以結合。
【學位授予單位】：河南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R776.1

【共引文獻】

相關期刊論文 前2條

1 林燕瑜;李青;楊佩菲;;熱休克轉錄因子4與先天性白內障[J];福建醫(yī)藥雜志;2007年04期

2 裴雪婷;鮑永珍;;先天性白內障的基因診斷[J];眼科研究;2007年09期

相關博士學位論文 前3條

1 柯鐵;眼科遺傳疾病的分子遺傳學分析[D];華中科技大學;2006年

2 張?zhí)鞎?兩種遺傳性眼病致病基因的定位與突變研究[D];中國醫(yī)科大學;2008年

3 繆愛珠;HSF4對HLECs蛋白表達的影響及與老年性白內障的相關性研究[D];復旦大學;2009年

相關碩士學位論文 前2條

1 黃二文;一先天性白內障家系的分子遺傳學分析[D];華中科技大學;2009年

2 甘冠騎;應用GSTpull-down篩查HSF4b相互作用蛋白[D];華中科技大學;2011年

本文編號：2563146